2.1培养基厚度：纸片法药物敏感性试验主要是利用药物扩散原理，药物在培养基上通过扩散在一定范围内形成抑菌药物浓度从而达到抑菌的效果。抑菌试验常用的培养基厚度一般为5mm左右，而在临床中受到操作者技术的影响，不同平皿培养基的厚度不可能相同甚至差别很大，同种药物不同平皿上的试验结果也不会相同，即培养基厚度越大药物的抑菌环越小。

2.2用水的质量：制作药物敏感性试验的培养基用水在很大程度上也影响着药敏试验的结果。用水的影响主要是矿物质离子的影响，如Ca2+、Mg2+、Al3+等离子，它们对药物的影响机理参见与本文的1.3.4节。

2.3 PH值：培养基PH值也是影响药敏试验结果的重要因素之一。PH值主要是影响药物稳定性和活性。PH值对药物稳定性和活性的影响参见与本文1.3.2节。

2.4 培养基成分：培养基的配制、营养成分以及杂质的种类等都可以影响药敏试验的结果。培养基配制浓度较高或融化不良以及厚薄不均等均可能影响药物扩散；培养基中的蛋白质可能和部分蛋白质结合率高的药物结合而影响药敏试验结果。部分药物蛋白质结合率如下：青霉素≧50%、盐酸多西环素≧75%（犬）、红霉素≧70%；而氨基糖苷类药物结合率却很低（20%左右）。培养基中的杂质的种类也可能在某些方面影响药敏试验的结果。

3细菌因素

细菌的菌层厚薄（或涂菌的多少）和细菌生长的特性是影响药敏结果的主要因素。药物杀灭细菌存在一定的量比，药敏试验培养基上细菌层越厚抑菌环就越小，反之抑菌环就越大。有些细菌在培养基上生长时会发生移动（鞭毛运动），当药物失效或培养时间太长，这类细菌有可能向已经形成的抑菌环移动，这也导致抑菌结果判断的失误。