2.1 CRISPR-Cas9 基因驱动的分子、生态和进化限制

　　此文章的第二部分介绍基于CRISOPR-Cas9 的基因驱动系统用于杂草管理的潜力。在研究此问题时，有必要考虑能使基因驱动用于杂草管理以及限制其成功的分子、生态和进化因子。本文简要地介绍了这些因素，因为它们与基因驱动的可行性、效果与扩散率(时间和空间上)和进化稳定性有关。在下文特别参考杂草植物的生物学来分析这些因素。

　　第一限制因素为与CRISPR-Cas9 基因编辑相容的靶标生物的遗传转化系统的构建。这不成问题时，种群水平基因驱动的分子遗传潜力将取决于与归巢效率有关的数个因素。Cas9 核酸酶必须确实剪切靶标序列的基因组;成功地对多种害物进行Cas9 基因组编辑表明这不会是一大限制。剪切特异性对精确基因编辑或敲除重要;而在大的基因组中可能存在大量相似的、脱靶序列，故较难达到。成功拷贝和扩散基因组的关键是，确保剪切序列通过同源重组而不是经非同源末端连接途径修复。同源与非同源DNA 修复途径的相对比率在不同生物体间和不同组织间可能不同，同源修复率会对基因驱动元件的扩散形成固有的限制。在设计不同昆虫品种的核酸内切酶基因驱动研究中，对于蚊子大于97%的剪切被成功地拷贝，而对于果蝇只取得不到78%的成功。确保对杂草的高比率同源DNA 修复是潜在应用基因驱动系统的必要第一步。

　　即使高比率地把杂合个体转换为纯合体，基因驱动仍需要多代来在种群中扩散。基因驱动扩散比率取决于种群的大小和生活史参数。例如在以下情况基因驱动扩散迅速：⑴ 相对靶标种群的大小，引入了大量的个体;⑵ 与驱动有关适合度代价值低;⑶ 一代时间短;⑷ 靶标品种异型杂交;⑸ 花粉扩散和种子移动介导的基因流动率高。

　　和显著降低害物适合度的所有防治策略一样，基因驱动也必进化，靶标种群的适合度恢复，种群能存活。基因驱动的抗性进化也可能发生，这是因为进行编辑点的识别、剪切和拷贝的分子机器不能正常发挥作用或选择基因组其他部位的等位基因，通过补偿进化使适合度恢复。

　　3 应用CRISPR-Cas9 基因驱动防治杂草

　　基于CRISPR-Cas9 的杂草种群压制的前提是基因驱动能被用于引入和扩散适合度负荷(fitnessload)，适合度负荷能够限制杂草种群的建立、丰度、分散、持续性和影响(图1)。

　　这可能通过以与竞争、种子休眠、持续性、物候节律和形态学有关的杂草性状为靶标的基因操纵来获得，虽然目前这些方法潜力有限，因为不完全了解杂草性状的分子遗传基础。尽管如此，在小麦育种中已利用的Rht-1 矮化病基因的同源染色体可在相关禾本科杂草中确定。如果这些基因能够在种群中扩散，就可降低杂草的竞争能力。相似地，对杂草型水稻的研究已阐明有助于野生水稻持续性和扩散的进化的种子休眠和落粒性性状的遗传基础，此为降低农业生态系统中杂草适合度的另一分子靶标。也研究了使苋属等雌雄异体杂草品种性比率偏离正常的减数分裂驱动系统。对植物繁殖的研究集中于基因操纵，例如干扰配子的形成，限制授粉或卵细胞的产生，导致产生的配子数量减少。新兴的杂草基因组学领域已认识到了解杂草性状如何进化和其如何作为改良作物的遗传变异的潜在新颖来源的分子遗传基础的研究价值。鉴于直接遗传防治杂草的潜力，如果基因驱动系统能被用于敲除或修饰野生种群杂草性状，这些努力就会取得更大的成果。

　　虽然引入的压制种群的基因驱动的扩散可能受到地理或生物限制，但理论上，如果不加约束地扩散，可能会导致害物的灭绝。由于人们对种群压制驱动的伦理、监管和生物学关注，数人已提出保护此技术限制其时空扩散的措施。其中敏化驱动为增加靶标种群敏感度，随后进行管理或环境干预，此技术有可能通过监管批准和随后用于杂草防除。

　　敏化驱动具有较多优势：压制种群不取决于驱动元件，而是随后的管理，可在时间和空间上控制其应用。敏化驱动可被设计为扩散对生物适合度没有固有负面影响的工程化基因，有助于此基因的扩散，但更重要的是确保在特异性管理干预条件下进行种群压制。在杂草管理方面敏化驱动最主要的应用为把抗除草剂种群转为除草剂敏感种群。因为大多数除草剂靶标广为人知，许多抗性突变已被研究清楚，因此这在技术上可行(虽然需要开发杂草的转化系统和面对用CRISPR-Cas9 系统对这些品种的基因组进行编辑的技术挑战)。在杂草种群中扩散敏感性使杂草的敏感性达到能有效防治的程度，这需要数代，在此期间靶标除草剂不能被使用因为此除草剂会杀死携带使杂草敏感性恢复的元件的植物。即使在成功驱动后种群中仍有低频抗性个体，这可能导致对推荐使用的除草剂会快速发展抗性。随后必须对新的敏感种群进行抗性管理。也应该认识到随着此方法的应用会逐渐发现还没有完全弄明白的基因测定和遗传结构的复杂的、多基因机制除草剂抗性广泛扩展。