卵黄抗体(IgY)指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体。自1893年Klemperer首次报道鸡蛋中存在抗体以来,卵黄抗体的研究不断深入,目前在卵黄抗体的形成、生物学特性等方面已研究得比较清楚,并且卵黄抗体作为诊断试剂和防治药物的研究愈来愈受到关注。本文就免疫鸡卵黄抗体的研究进展作一综述。
1、卵黄抗体的形成
禽类的免疫系统包括细胞免疫和体液免疫,分别受胸腺和法氏囊的控制。当机体受到外来抗原刺激后,法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞,分泌特异性抗体进入血液循环,当血液流经卵巢时,特异性抗体(主要是IgG)在卵细胞中逐渐蓄积,形成卵黄抗体;当卵细胞分泌进入输卵管时,流经输卵管的血液中含有的特异性抗体(主要是IgA和IgM)进入卵清中,形成卵清抗体。IgG移行进入卵细胞是受体作用的结果,因而IgG可在卵细胞中大量蓄积,浓度高于血液中的IgG。与卵黄抗体相比,卵细胞在输卵管中移行的时间较短,因而卵清抗体含量极微。卵黄抗体在禽胚孵化过程中逐渐进入禽胚血液,为刚出壳雏鸡提供被动免疫保护,在雏鸡疾病预防中具有重要作用,但同时也会干扰鸡疫苗的免疫效果。
2、IgY的性质
IgY的性质与哺乳动物的IgG相似。正常鸡IgY的分子量约为180KDa,由两条轻链(2L)和两条重链(2H)组成,分子量分别为60-70KDa和22-30KDa。其等电点约为5.2。
IgY与一般哺乳动物IgG相比,IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力。
在低于75℃条件下,IgY具有良好的热稳定性。IgY制剂在4℃贮存5年或在室温贮存6个月其活性仍无明显变化或下降,65℃时可保持24h以上,70℃时加热90min后其活性才明显下降60℃,30min条件下巴氏消毒不影响IgY;高于80℃,大部分IgY失去活性。
IgY在pH4.0-11.0时比较稳定,pH3.0-3.5时活性迅速下降,pH12时活性亦有所下降。
IgY对胃蛋白酶有较高的抵抗力,但对胰蛋白酶十分敏感。将胃蛋白酶和IgY在pH2.0温育1h后,几乎所有活性丧失,但在pH4.0时1h后可保持91%的活性,甚至温育10h后仍有63%活性。IgY分别与胰蛋白酶和胰凝乳酶温育8h,活性分别保持39%和41%。
3、IgY的作用机理
特定病原菌的卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上,改变病原细胞的完整性,直接抑制病原菌的生长;卵黄抗体可黏附于细菌的菌毛上,使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞;一部分卵黄抗体在肠道消化酶作用下,降解为可结合片段,这些片段含有抗体的可变小肽(Fab)部分,这些小肽很容易被肠道吸收,进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合,使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性,而IgY的稳定区(Fe部分)留在肠内。
4、IgY分离、提纯方法
卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪,其比例为1:2。大部分蛋白质都是脂蛋白,存在于卵黄颗粒中,不溶于水,只有卵黄球蛋白(α、β、γ)是水溶性的,而IgY是γ卵黄球蛋白。因此IgY的分离纯化首先需要有效地去除卵黄中的脂类,从水溶性蛋白中分离IgY。
多年来,已建立了许多较为高效而经济的方法,这些方法大多以PEG、硫酸葡聚糖、天然胶,如藻酸钠、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步纯化蛋白质。
1980年,Polson首先提出聚乙二醇(PEG)两步沉淀法,分别用终浓度为3.5%和12%的PEG分步沉淀,用硫酸铵盐析法去除PEG。1985年,在此基础上提出了冷乙醇沉淀的改进方法,使产量提高,而且能有效地去除残留PEG。1981年Jensensius等提出了硫酸葡聚糖沉淀法(DS法),PEG法和DS法的产量相当,但提取的IgY制品含有一定量的杂蛋白。Bade和Stegemann(1984)用预冷的丙烷和丙酮(-20℃)沉淀蛋白质并去除脂质,经DEAE柱层析进一步纯化,其IgY抗体活性与用Polson法提纯的IgY之间无明显差别,且稳定性好,经3次以上冻融,抗体活性未见改变。1992年Akita等用水稀释法(WD)提纯IgY,每个卵黄可获得100mg以上的IgY。此后,Akita等比较了WD法、PEG法、DS法和黄原胶法(Xanthan法)的提纯效果,结果表明:WD法产量最高,其次为DS法,WD法更适合大规模生产。
1993年,Horikoshi提出了冷乙醇分级离心的方法,分别用60%、30%、25%的冷乙醇沉淀离心,得到纯度达99%以上的IgY。此法适用于大规模制备IgY。
工业上大规模生产IgY的方法有:超临界二氧化碳气体抽提法、卡拉胶法、硫酸铵盐析法。
5、IgY在动物疾病防治方面的应用
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