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猪伪狂犬病的诊断技术


    疾病综合症状的典型表现是实验室外诊断中一个相当可靠的根据。也可以从病史和同一农场中猫和(或)狗的反应获得补充。尸体剖检所观察到的典型病变,也增加实验室外诊断等需要的证据。若要保证实验室诊断的结果,必须在动物出现昏迷时进行捕杀或从死亡不超过一小时的猪只尸体采集组织。

    诊断

    可采用多种特殊方法来检测猪组织或猪血清中的伪狂犬病病毒(PRV)或抗体。特异性或敏感性稍差的那些方法往往用于筛选大量的样品,以节约使用较复杂技术所需要的开支。

    组织和血清:诊断以在组织中分离到病毒为基础,要求条件适宜,如组织新鲜,操作仔细和精确。采用的组织是扁桃体、脑干和大脑。用于病毒分离的组织要在使用前预先冰冻,那些用于荧光抗体染色的必须冷藏以防止其自溶,但冰冻破坏细胞的完整性和影响制片的效果。对猪的血液样品要操作仔细,尤其在冷天,因为红细胞裂解得很快。用于病毒中和实验的血清样品往往对指示细胞具有毒性。产生毒性的诸多因素是含有化学试剂的试管、释放离子的塞子、冲洗注射器所用的抗菌剂和洗涤剂残留物及细菌等。必须让血液样品在室温下有足够的时间凝固,使血清在冷藏前和凝块开始分离。冷藏是为防止细菌增殖和有助于凝块收敛。

    病毒分离:要防止用于准备分离病毒的材料与肝素、琼脂或其它的磺基化多阴离子物接触,因为这些物质阻碍病毒吸咐细胞。对被怀疑含有PRV的组织,可利用各种体外技术证实。将组织浸出物接种到原代或次代细胞。在34℃~37℃条体下培养至多7天。虽然曾用过多种细胞来源,但最常用的还是猪肾。用被检的猪肾组织制备细胞,新出芽生长的细胞即可作为指示细胞;或者,用被检的猪肾组织剪碎与指示细胞一起培养,通过这两种方法都可观察到指示细胞出现的病变。虽然PRV的细胞病变很典型,可以做出假设性的定性,但仍需对获得的细胞培养液用病毒中和试验进行鉴定。

    病毒中和试验:试管VN试验作为一种试验程序已被获准。在美国,VN试验已被列为州和联邦政府法定的试验方法。它虽很敏感但还不是最敏感的,它的临界值经常引起争论。此程序要求被检动物的血清送往实验室,一般一星期后便可得到结果。据估计,0.5%~1%的血清样品(夏季更高)对指示细胞具有毒性,因而需要再次采集样品,所以试验经费和人力消耗井不算小。

    免疫荧光:间接免疫荧光抗体试验可用来解诀不肯定的反应和确定猪以外其它动物发生的猪疱疹病毒。直接免疫荧光抗体试验具有快速简便的好处,大约可在1小时内完成,比VN试验特异性差但敏感。然而,此方法也像VN试验那样不能做大量样品的测定。

    酶联免疫吸附试验:这个试验(ELISA试验)用一种酶作为免疫球蛋白标记物,抗原(此试验中抗原为PRV)吸附于微量滴定板孔,然后加入血清。组织中如存在抗体,它便会与抗原起反应。冲洗掉过剩的抗原后,加入碱性磷酸酶或过氧化物酶标记的抗猪球蛋白,用加人酶底物来确定结合的抗免疫球蛋白的数量。此底物被酶转化,以至可见到颜色,颜色量可用读数仪读出。对测定抗PRV抗体来说,这是一种简便、快速、可靠、重复性好的试验,比VN试验更敏感,大约6小时后便可获得结果,且只需少量血清。

    琼脂凝胶免疫扩散试验:本试验简单易行,24小时~48小时内出结果且成本低,亦可用来检测有细胞毒性、溶血或污染的血清,只需掌握简单技术就可操作。它的严重不足是敏感性不如VN或ELISA试验。

    补体结合试验:与VN试验是一致的。用补体试验(CF试验)检测热灭活猪血清中PRV抗体需要用未经热处理的正常血清或猪补体C1q成分作为补充。稀释度较低的多数猪免疫血清必须用巯基乙醇处理。CF试验需要大约24小时,并需要相当程度的专门技术,所用制剂要求小心操作和管理。

    皮肤试验:是以PRV的细胞介导免疫为基础。它不像VN或ELISA试验那样敏感,然而,它确有价值和诱人的用途,如作为畜群普查的方法,或作为净化农场的目的。只有当反应明显时,判为阳性才可靠。在野外对猪的诊断大约16小时就可得出结果,最大的达24小时。本试验经济、快速、重复性好,便于操作。它的应用减少了需做诊断的血清样品的数量。唯有那些皮肤试验为阴性的,需要作进一步测定以决定它们的免疫状况。


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