2.3 琼脂免疫扩散试验

Murty等(1961)首次报道采用琼脂扩散试验诊断DHV。通过不同距离、不同浓度的抗原与高免血清沿琼脂带发生的琼扩反应,可用来检测病毒抗原的滴度。许伟琦等试验表明在琼脂中加入2%PEG能加快反映速度。张济培等用琼扩试验检测提纯后的DHV,发现琼脂凝胶配制的最佳方案是pH7.2,NaCl为80 g/L和琼脂糖浓渡为10 g/L。琼脂扩散试验虽然简便易行,但准确性存在欠缺,并且有干扰,因此存在着一定的局限性。

2.4 间接血凝试验

司兴奎等报道在纯化DHV获得较为满意结果的基础上,进一步应用纯化抗原进行间接血凝试验（IHA）。孙泉云等将初提DHV经Sephadex G200柱层析纯化后作为致敏抗原,戊二醛法固定绵羊红细胞,BDB法致敏抗原红血球建立了检测DHV抗体的IHA方法。IHA试验敏感性高,所以致敏用抗原的纯度要求高,而且必须保持良好的免疫活性。还有报道说21日龄前不易检测到IHA抗体。所以对DHV早期诊断不适用。在敏感性和稳定性方面有波动,限制了该方法的推广应用。

2.5 直接荧光抗体检测

Maiborda(1972)报道了快速和准确的诊断方法是接种雏鸭采用直接荧光抗体检测（FA）。用FA确定了北京地区流行的DHV为I型。胡清海等用鸭胚细胞做成滴片进行FA检测DHV。刘建采用感染新型鸭肝炎强毒后死亡鸭的肾细胞做滴片进行荧光染色,可检测到病毒抗原存在,为临床上快速诊断新型鸭病毒性肝炎提供了一种检测方法。该方法准确简便,但对设备要求较高。

2.6 斑点免疫金渗滤法

张小飞等[18]用胶体金标记提纯后的兔抗鸭肝炎病毒(DHV)IgG,建立了一种以微孔滤膜为固相载体,以红色胶体金为标记物的检测DHV的斑点免疫金渗滤法（DIGFA）,并确定了最佳试验条件。该法既可定性,亦可定量,对纯化DHV的最小检测量为4.12 ng/点,其敏感性为抗原斑点试验(AST)的2倍。DIGFA 法具有敏感性高、特异性强、重复性好等优点。但其要求较高的抗原纯度,这一点难以达到。

2.7 酶联免疫吸附试验

应用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）进行抗原、抗体的检测,比较敏感、快速,已经广泛应用于各种疾病的诊断。

赵新柳等首次建立了间接ELISA法以检测DHV抗体,结果表明，ELISA阳性检出率为100%。陈溥言等[20]报道了DHV单克隆抗体的成功制备,并建立了检测DHV的夹心ELISA方法,随后范伟兴等[21]用单克隆抗体建立了Dot-ELISA检测方法。杨奎等用辣根过氧化物酶标记法成功地检测了DHV抗体。该法与以polyomyl板或polystyrene为固相载体的ELISA法相比,抗原用量少,很适于DHV这类难以提纯的病毒的抗体检测。孙泉云等将单抗的高度特异性与ELISA的高度灵敏性结合起来,建立了用以检测DHV抗体的单抗捕捉法ELISA方法,该法能有效区分阴、阳性血清,非特异性背景很小。同时对抗原的纯度要求也很低,甚至是尿囊液也能克服非特异性反应。杨萍萍等制备了DHV单克隆抗体,并用于检测DHV。马秀丽等[23]用辣根过氧化物酶标记纯化的Ⅰ型DHV单克隆抗体建立了检测DHV的Dot-ELISA法。

很多学者建立了用以诊断DHV的ELISA方法,其优点是灵敏度高,操作简便,特异性强。但因病毒的纯化和DHV阴性血清的制备等均存在一定难度,该方法在DVH的检测诊断方面还未能得到广泛的应用。

2.8 其他血清学诊断方法

在DVH的诊断上除上述方法外,用来诊断鸭病毒性肝炎的方法还有被动血凝试验，SPA协同凝集试验，胶体金免疫电镜技术，单克隆抗体-PAP法和核酸探针等方法,但因某些原因均还存在一定争议,未能得到广泛推广和应用。

3 小结

尽管多年来国内外很多学者对DHV进行了大量研究,但到目前为止,尚未能摸索出一种便捷的提纯程序,因而至今尚未得到纯化的病毒,这就使病毒的深入研究大受限制,对其分子生物学特性的研究也难以着手。因此,继续进行病毒提纯方法的改进,将显得尤为重要。

对于DHV诊断方法的研究,已经取得了一定的成绩,建立了许多基于血清学的诊断方法,基本能够快速简便地做出实验室诊断,但基层应用存在一定的困难。也有很多学者建立了DHV的cDNA文库,但还都有待于验证,并未见公开的DHV序列报道。因此,应加紧其分子生物学研究,明确病毒的核苷酸序列，基因结构，编码蛋白质的方式。用基因工程技术表达的重组抗原,或根据蛋白质分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列。人工合成的多肽片断抗原运用到免疫学检测方法中,或建立一种快速而准确的分子生物学诊断方法,以解病毒是否存在着变异等难题。(《动物医学进展》 霍翠梅,韦 强等)