3.3 免疫荧光技术

免疫荧光技术(IF)即荧光抗体(fluoresent antibody，FA)技术，是鉴定和定位流感病毒感染细胞中特异性的抗原，主要是流感病毒的核蛋白(NP)或基质蛋白（MP抗原）。用NP抗原的荧光抗体染色，主要出现核内荧光；用MP抗原的荧光抗体主要出现胞质荧光，核内也有部分荧光。

用于禽流感病毒的诊断，常用直接荧光抗体法，即在组织触(印)片上直接染色，以荧光显微镜检查荧光。一种AIV的荧光抗体可以用来检测同亚型的其它病毒。荧光抗体技术用于诊断，具有快速、简便、敏感等特点，而且费用较低。需要注意的是，如何避免或降低标本中出现的假阳性问题(非特异性荧光)。荧光抗体(FA)的敏感度同病毒分离相当，有时高于用鸡胚进行的病毒分离。

间接免疫荧光技术也可以用来检测NP及MP抗原与抗体的反应，其敏感性很高。但对抗原制备要求较高，需用非离子型去污剂对纯化的病毒粒子进行裂解[4]。

FA技术同放射免疫测定技术(radioimunoassay，RIA)一样敏感，既没有放射性同位素的处理问题，也不需要液体闪烁计数器或γ计数器。

3.4 放射免疫测定法

放射免疫测定法(RIA)是利用放射性同位素示踪技术的高灵敏性与免疫技术的特异性相结合的一种可定量分析测定方法。

标记中常用的放射性同位素是125I，以化学方法将其标记到抗原或抗体分子上。液相RIA要用液体闪烁仪或γ计数器来分析测定反应结果。固相RIA可与免疫沉淀或电泳技术相结合，通过放射自显影来分析结果。

可用125I标记的兔抗鸡IgG与禽流感抗血清及抗原进行反应测定(固相法)。可以进行抗原变异的分析(根据反应结合率)。因放射性同位素的污染问题，RIA正被ELISA等同样敏感技术所取代。

3.5 核酸检测技术

以核酸探针(放射性标记或非放射标记)可以定位组织中参与病毒复制的感染细胞。由于核酸分子杂交具有很高的敏感性和特异性，用液相或固相杂交可进行诊断，检测病毒的核酸。

用同位素标记病毒的寡核苷酸片段进行垂直双向电泳，根据放射自显影的“指纹图谱”可分析不同毒株的核酸差异[5]。

4 禽流感病毒亚型的鉴定

分离病毒被鉴定为A型禽流感病毒后，应进一步确定其H和N亚型。流感病毒有16个H亚型和9个N亚型，可以分别通过HI试验和NI试验来鉴定。

4.1 HI试验

先要测定分离病毒的HA价，然后用4个HA单位的病毒与分型血清进行HI试验。使50%红细胞凝集抑制的最高稀释度作为判定终点。试验应注意抗原稀释液浓度必须为4 HA单位，在每次使用前滴定并配制，应避免杂菌污染导致的非特异性结合。

4.2 NI试验

NI试验比HI试验复杂得多，一般的诊断实验室不能完成，应由专门从事禽流感研究的禽流感参考实验室完成。目前已经用山羊制备了9个NA亚型中的8个亚型的抗血清，这些参照抗血清是用纯化的NA制备的，是特异的。参照抗血清是用来区分不同的NA亚型，但是在单独用某种NA亚型检测不同的毒株时，会出现广泛的交叉反应。需要注意的是HA的抗体可能对NA有封闭作用，从而得到错误的结果。

在NI试验中，血清中的抗体可以区分不同的NA亚型，抑制胎球蛋白底物上的病毒酶活性。每支被检流感病毒管中都加入了病毒样本和参照抗血清，将此结果与病毒对照组(病毒样本+PBS，未加抗血清)比较，被检病毒颜色锐减或无色的管则表明其NA活性被这个亚型的参照抗血清抑制，每个被检病毒一定被一种NA亚型的抗血清抑制，据此，即可判断被检病毒样本的NA亚型。但是，有时在不同的NA亚型间出现交叉反应，此时要补充进行其他的实验，帮助确定判断结果。可以在抑制试验中提高抗血清的稀释度或用备用血清来解决这一问题，或者进一步通过NA基因测序来判断[6]。

5 禽流感病毒致病力的判定

新分离的禽流感病毒还要进行毒力测定，可采用易感动物试验和血凝素裂解位点氨基酸序列测定来判定其毒力。根据OIE标准，以0.2 mL（1∶10稀释）的无菌病毒感染尿囊液，接种8只4周龄～8周龄SPF易感鸡，隔离饲养，10 d内导致6只或6只以上鸡只死亡的病毒为高致病性的禽流感病毒。即使没有达到上述75%死亡率标准，但是确定是H5或H7亚型，其血凝素的裂解位点存在一系列连续的碱性氨基酸，也视为高致病力禽流感。

静脉接种致病指数（intravenous pathogenicity index, IVPI）也可用于判定毒力，采取以下的判定标准：由A型流感病毒引起的家禽的感染，其致病指数判定为：接种6周龄的SPF鸡，其IVPI大于1.2的，或血凝素的裂解位点处有一系列连续的碱性氨基酸存在的H5、H7亚型流感病毒，判定为高致病力病毒[2]。