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鸡新城疫诊断技术



自1926年认识新城疫(ND)以来,许多国家都把ND看作是地方性流行病。除少数几个国家按商业级别生产家禽外,所有国家都作预防免疫接种。

  鸡新城疫病毒(NDV)不同毒株的最特征的性质之一,是对鸡的致病性差别很大。根据在感染鸡所引起的临床症状可将NDV毒株分为5个群或病型,它们是:亲内脏的强毒力型,特点是高致病性,常常见到肠出血病变;亲神经的强毒力型,特点是有高的残废率,常有呼吸和神经症状;中等毒力型,特点是有呼吸症状,偶有神经症状,但残废率低;温和型或呼吸型,特点是症状温和或者亚临床型呼吸道感染;无症状的肠型,特点是常为亚临床型肠感染。
  病型的划分很难界限分明,甚至在感染的无特定病原(SPF)鸡上也可以看到各型症状的重叠。此外,当与其他微生物混合感染或者当环境恶化时,温和毒株也可引起明显的临床症状。
  由于鸡感染后的临床症状差别很大,不同宿主对感染的反应也不一样,这使诊断更为复杂。因此依据单一临床症状不能作为诊断ND的基础。若出现强毒力病型的有关症状和病变应怀疑本病。

  ●病原鉴定:

  1.样品采集
  从死禽采集的样品有口鼻拭子,还有肺、气囊、肠、脾、脑、肝和心组织,这些样品可单独或混合采集。
  从活禽采集的样品应包括气管和泄殖腔拭子。在采集样品机会少的地方,除了受感染的或者有相关临床症状的器官和组织外,主要的应是泄殖腔拭子(或粪便)和气管拭子(或者气管组织)。
  2.样品处理
  样品置于含抗生素的磷酸盐缓冲液(pH7.0至7.4)中,抗生素视具体情况而变化,但对组织和气管拭子应含青霉素(2000单位/ml),链霉素(2mg/ml),卡那霉素(50μg/ml)和制霉素(1000单位/ml),而对粪便和泄殖腔拭子其浓度要提高5倍。加入抗生素后调节pH值到7.0至7.4是很重要的。粪便和搅碎的组织,应用抗生素溶液制成10至20%的悬液。样品应尽可能快地处理,首先在室温下静置1至2小时。没有条件的话,样品可在4℃保存几天。
  3.样品检查
  粪便或组织的悬浮液经离心后取上清液,尿囊腔接种至少5个9至11天的SPF鸡胚,在35℃~37℃培育4至7天。收集死的和快死的以及培养结束时活下来的鸡胚尿囊液,于4℃致冷,随后检测尿囊液的HA活性。阴性者至少用另一批蛋再传代一次。
  用特异性的抗血清可以证实NDV的存在,通常使用鸡的抗血清,它们是用NDV毒株中的一个毒株制备的。
  试验以相同的血清PBS作连续对倍稀释,每孔0.025ml,随后每孔加入4个血凝单位的抗原0.025ml,作用15至30分钟后,加入1%的0.025ml鸡红细胞,轻轻混匀,45分钟判定结果。能完全抑制4个抗原的血清最高稀释度即为血凝抑制(HI)滴度。将板倾斜判读,凝集试验更准确。只有那些孔的红细胞同不含病毒对照孔的红细胞出现相同的“流动”时才认为是血凝抑制。
  有些非鸡的禽类血清含有对鸡红细胞所特有的非特异性凝集素,因此,可用鸡血红细胞吸收试验血清,以排除凝集素或者采用研究对象的动物种的红细胞。
  4.分离株毒力评价
  不同NDV分离株的毒力很不相同,而且由于新城疫活苗的广泛应用,仅从具有临床症状的病禽分离出病毒进行鉴定,不能构成对ND的诊断,还应进行分离物毒力的评定。NDV分离株的致病性不能在体外进行,所以评估致病性常根据下面一种或多种试验来确定。
  a)鸡胚平均死亡时间(MDT)
  将新鲜的感染尿囊液用生理盐水连续10倍递增稀释成6Log10~9Log10,每个稀释度接种5个9至10日龄的SPF鸡胚,每个鸡胚接种0.1ml,随后置于37℃。剩余下的病毒稀释液保存于4℃,于8小时后,每个稀释度接种另外5个鸡胚,每个鸡胚接种0.1ml,置于37℃培养。每天观察二次,共观察7天。每次观察都要记录每个鸡胚死亡的时间。
  利用鸡胚平均死亡时间可将NDV株分为强毒力型,其死亡时间低于或等于60小时;中等毒力型,其死亡时间在61至90小时之间;温和型,其死亡时间大于90小时。
  b)脑内致病指数(ICPI)
  4Log2以上血凝滴度的新鲜感染尿囊液,用等渗无菌盐溶液作10倍稀释,不加添加剂,脑内接种1日龄的SPF雏鸡,共接种10只,每只接种0.05ml。每24小时观察一次小鸡,共观察8天。每一天观察应给鸡打分,正常鸡记作0,病鸡记作1,死亡鸡记作2,脑内致病指数是每只鸡8天内所有每次观察数值的平均数。最强毒力病毒的脑内致病指数将接近最大值2.0,而温和型毒株的值接近0。


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