2.6电解质的浓度：电解质的浓度对琼脂扩散试验的结果影响也很大。抗原抗体具有胶体性质，含有氨基、羧基、肽链等极性基团，与水相互结合，形成水化层，因为蛋白质带有相同的电荷，所以胶体所带电荷相同，互相排斥，在水中稳定存在，抗原抗体带有相反的极性，等两者结合后，表面的电荷减少或消失，水化层也减弱，由亲水型变为疏水型，此时如有适当浓度的电解质，能进一步降低抗原抗体表面的电荷，促进他们沉淀，最常用的电解质为氯化钠，哺乳动物血清学反应浓度为0.15mol，即生理盐水，禽类8％[8]。但过高浓度的电解质反而不利于抗原抗体沉淀物的形成，有两个原因：○1过高浓度的电解质阻止蛋白质与水分子的相互作用，破坏蛋白质表面的水化层，产生盐析效应，使抗原抗体发生非特异性的沉淀。○2过高浓度的电解质浓度（大于或等于15％）可使抗原抗体结合物离解。见本文1.1.2。

2.7孔间距离：抗原抗体的孔间距离也能影响琼脂扩散试验的结果。当两者之间的孔距为3mm时，抗原抗体既能形成合适的浓度梯度又能充分结合。当两者的孔间距离过大时，虽然能形成合适的浓度梯度，但由于抗原抗体量太少却不能充分结合，相反孔距太小，虽然结合的量很大却不能形成合适的浓度梯度，都能影响琼脂扩散试验的结果。

2.8琼脂水分：琼脂凝胶网格内含有大量水分，如果琼脂板储存时间太长或储存环境太干燥又没有放在密闭环境中，水分就会大量的挥发，直接影响抗原抗体扩散的效果。

3抗原抗体反应条件

一些培养条件如反应温度、反应湿度、反应时间也是影响琼脂扩散试验结果的重要因素。

3.1反应温度 影响琼脂扩散试验结果的温度因素包括:反应温度的高低与反应温度波动情况。

3.1.1反应温度的高低：抗原抗体的反应速度、结合程度与反应温度高低有密切关系。温度高，分子运动加快，增加抗原抗体碰撞几率，反应会加快，但当温度超过56℃时反应速度反而变慢，温度再高，抗原抗体复合物往往会重新解离，甚至会被破坏。例如卵黄抗体在≥65℃情况下性质就会变得不稳定，鸡马立克氏病毒从感染鸡皮肤中制备的脱离细胞制剂在56℃处理30分钟或在60℃处理10分钟都能失活，传染性法氏囊炎病毒在70℃处理30分钟失活[6]。反应温度低时，反应速度变慢，但抗原抗体结合完全，沉淀量增多，结果清晰。但温度过低，反应无法进行，也不会出现结果。最适的反应温度为37℃[8]。

3.1.2反应温度的波动情况:琼脂扩散试验的培养温度应恒定，如果波动太大，会使抗原抗体在扩散时形成不连续的浓度梯度，影响两者产生最适比，最终影响到实验结果。

3.2空气湿度：琼脂扩散试验是抗原抗体在琼脂网格中的水中扩散时形成的结果，如果空气中湿度太低，琼脂中的水分很容易蒸发，使琼脂网格中的水分减少，不利于抗原抗体的自由扩散，同时加到琼脂孔中的抗原抗体的水分也很容易蒸发，使卵黄中的抗体及抗体被固定在孔中不容易向琼脂凝胶中扩散。所以在培养时，往往倒置平皿，然后放在一个有湿棉纱布的有盖搪瓷盘中，以防水分蒸发。

3.3反应时间：抗原抗体在琼脂中的扩散需要一定时间。如果反应时间太短，使抗原抗体没有完全扩散以致结合的不充分或结合后还没有达到沉淀的程度，导致本应形成的沉淀线没有出现；时间太长，在室温条件小，大量抗原抗体会失去生物活性，已经形成的沉淀带发生解离消失而出现假像。

4其他因素
抗原抗体加的多少、打孔后琼脂底部融封效果都能影响琼脂扩散试验的结果，本文1.3所述。当抗原抗体的量加的多时，所产生的沉淀线粗，为了减小各个实验的相对误差，加样时，都应加到满而不溢程度。此外，打孔后琼脂板底部松动，如果不加热封好，在实验过程中，抗原抗体就不通过琼脂网格扩散，而是直接在底部流出，不会产生沉淀线。