1.2.2抗原抗体反应的可逆性[3]：抗原抗体之间的结合是依靠分子间的近距离力：氢键、范德华力、静电力、疏水作用力。两者的距离越近，结合的位点越多，形成的近距离力也越大，结合的也越牢固。这些作用力在生理状态下最大。由于抗原抗体反应是分子表面的非分子结合，所形成的复合物并不牢固，可以随时解离，解离的抗原抗体保持原来的生物活性，可与其它的抗原抗体再一次结合，在整个反应体系中形成动态平衡，平衡式为：Ag+Ab≒AgAb。这种平衡易受到温度、PH等物理的、化学的因素的影响而改变。当温度大于60℃，PH值降到3以下时，由于同离子效应等因素，使抗原抗体蛋白质的近距离力遭到破坏，结构发生改变，导致抗原抗体复合物重新解离。

1.2.3抗原抗体的总量：琼脂扩散试验中所形成的沉淀线的粗细、清晰度与抗原抗体的量成正比例关系。因为我们这篇文章主要是讨论影响卵黄抗体效价测定的因素，所以主要考虑影响抗原的外界因素。抗原反复冻溶以及长期把它放在室温下都能使大量的抗原破裂失去活性。所以在保存与运输抗原时应放在冷冻条件下进行。

1.3抗原抗体的纯度：抗原与其对应的抗体的反应属于特异性反应。但是如果两者含有过多与反应无关的蛋白质、类脂质、多糖等非特异性物质，往往抑制抗原抗体的特异性反应，而出现一些非特异性反应。

2琼脂因素

琼脂扩散试验的结果在很大程度上也受到琼脂的成份、琼脂板厚度、琼脂的浓度、实验用水质量、PH值、电解质浓度、抗原抗体孔间距离及琼脂水分的影响。

2.1琼脂的成份：影响琼脂扩散试验结果的琼脂成份因素主要是不溶性杂质。一些大的不溶性杂质能直接堵塞琼脂的网格，这样的杂质过多会影响抗原抗体的扩散，为了避免这些杂质的影响，应在琼脂粉融化后用脱脂棉或纱布过滤，或者选择高质量的琼脂粉加工琼扩板。

2.2琼脂板的厚度：琼脂板的厚度应为3mm左右，因为由于重力作用，加入孔中的抗原抗体会发生沉淀，导致上下层的浓度形成差，浓度大的向琼脂网格中扩散的速度要比浓度小的快，同时又由于抗原抗体的质量与体积的差异，所以两者形成的浓度差是不同的，扩散速度的差异也不同，如果琼脂板很厚，同一孔上下层扩散速度差异及抗原抗体之间扩散速度的差异都很大，致使抗原抗体孔之间形成的沉淀线上下层之间就不在同一平面上，影响琼脂扩散试验的结果的观察；相反如果琼脂板太薄，所加的抗原抗体量很小，沉淀线不清晰甚至不出现沉淀线。

2.3琼脂的浓度：琼脂凝胶网格允许通过物质的最大分子量与琼脂浓度成反比（见表1），卵黄抗体IgG的分子量为1.8×105[5],1％－1.5％的琼脂溶液网格能允许绝大多数大分子抗原自由扩散，大于这个浓度范围的琼脂网格太小不利于大分子抗原如鸡马立克氏病病毒（分子量为1.03×108）、鸡传染性喉气管炎病毒[6]的扩散，浓度太小琼脂骨架太少不利于抗原抗体复合物的沉淀，从而影响琼脂扩散试验的结果。`
表1琼脂糖凝胶Bio-Gel A型的数据[7]

型号 Bio-Gei A琼脂糖含量%分级范围 （球蛋白）

A-0.5m101×104～5×105

A-1.5m81×104～1.5×106

A-5m61×104～5×106

A-15m44×104～1.5×107

A-50m21×105～5×107q

A-150m11×106～1.5×108

2.4实验用水的质量：琼脂扩散试验的结果在很大程度上也受到实验用水的影响。如果实验用水中含大量重金属离子如铅、汞、铜等，会使蛋白质成份的抗原抗体变性失去活性，不能再发生特异性反应，影响琼脂扩散试验的结果。

2.5 PH值：抗原抗体大部分是蛋白质，蛋白质在一定的PH处所带的净电荷数为零，此时的PH值为蛋白质的等电点，大部分蛋白质的等电点在PH5-5.5之间，在等电点处，蛋白质分子之间静电斥力减少，趋于凝集状态而发生沉淀，所以蛋白质在等电点处的溶解度最低。当琼脂的PH在抗原抗体等电点处时，抗原抗体会发生非特异性的沉淀，影响琼脂扩散试验的实验结果。一般琼脂扩散试验的PH为6－8（比等电点稍高）[2]。当PH小于3时，往往使抗原抗体结合物变性或再次解离，如IgG在PH4.0－11.0稳定，马立克氏病毒在PH3或PH11处理10分钟失活[6]。见本文1.1.2。