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2 体外细胞学试验?

早期衡量从结核分支杆菌感染的牛体内的T细胞反应性的体外方法的发展主要集中在淋巴细胞变形试验（LTT）。LTT能检查PPD抗原的抗原特异性。若是把它看作结核菌素试验的一种替代试验，则有几个缺点：①需要从全血中分离淋巴细胞，这种技术耗时且能被检查的动物的数量非常有限；②需要在复合组织培养介质中培养这些细胞3 d～5 d；③需要用放射核酸技术检测细胞增殖水平。?

淋巴细胞的分离要受到用组织培养介质稀释全血样品的限制，但还有其他的限制的存在。这些条件意味着，如果淋巴细胞增殖试验对研究有意义，那么将其作为结核菌素试验的一种实用的替代方法无疑太复杂、太昂贵而且太慢了。因而，发现了一种迅速的全血培养系统，检查一种细胞因子——γ干扰素的释放，作为牛结核分支杆菌抗原（PPD）的阳性反应的指示剂^[12]。?

由T淋巴细胞和NK细胞产生的细胞因子γ干扰素对巨噬细胞的活性是很关键的， 且在介导细胞免疫中扮演着关键性角色。通过研究人淋巴细胞表明，记忆性T细胞有产生γ干扰素的潜力，但原始T细胞有削减细胞因子产生的能力^[13]。结核分支杆菌的ESAT-6是免疫记忆效应T细胞的主要靶抗原之一，可在再次感染的早期诱导其迅速增殖并释放高水平的γ干扰素，有效激活巨噬细胞，从而控制结核病^[14]。?

一种检测γ干扰素存在的生物学试验证实了γ干扰素与从淋巴细胞增殖试验得到的结果有很好的相关性。因此，研制重组牛γ干扰素的单克隆抗体，并用这些单克隆抗体开发了一种对牛γ干扰素敏感的酶免疫试验（EIA）。牛γ干扰素EIA一旦与全血培养系统相结合，就可产生一种特异、快速（24 h）和敏感的体外检测牛分支杆菌感染牛的特异性细胞免疫反应。加肝素的全血等分试验加入PPD一起培养16 h~24 h后，作γ干扰素EIA^[15]。假阳性反应的出现归因于所用的抗原样品的交叉反应性。通过使用对照试验可以在很大程度上得到克服假阳性，可在试验中设动物对牛PPD和禽PPD的γ干扰素反应的对照。?

在1989年-1990年间，澳大利亚在较广范围内对γ干扰素试验和SIDT进行了比较。对非结核感染区的6 000头牛试验后得出γ干扰素的特异性（96.3%）。从已知感染牛结核的牛群中抽出6 264头，用两种试验方法进行检查后证实了这两种方法的敏感性数值，结果经培养后确定了有125头感染了牛结核。γ干扰素试验表现出93.6%的敏感性，而结核菌素试验敏感性只为65.6%。而将γ干扰素和结核菌素试验同时应用，则可获得最大敏感性为95.2%。暴露于结核暴发区的动物，28头γ干扰素阳性牛中有16头也是抗体阳性。尤其是12头γ干扰素阳性，SIDT阴性牛中有7头对TB蛋白表现出抗体反应^[16]。?

在γ干扰素试验的早期试验期间就发现了细胞反应和体液反应的不同。多数牛MPT70-ELISA阳性，而对γ干扰素试验和结核菌素试验为阴性。Ritacco等同样发现了自然感染牛分支杆菌的牛细胞反应（γ干扰素）和体液反应之间存在负相关。?

γ干扰素试验优于结核菌素试验的一个特点就是，动物不会因为没有抗原进入体内而被延迟检查，且可重复检查。Radunz和Lepper发现结核菌素试验在60 d内可限制接下来的试验，因而牛在此段时间内不能再被检查。Rothel J S等发现感染牛分支杆菌的牛的结核菌素试验也影响了动物的γ干扰素反应，结核菌素试验后，紧接着就可发现7 d内γ干扰素反应下降，然后逐渐提高，至少可持续60 d