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2 体外细胞学试验?

早期衡量从结核分支杆菌感染的牛体内的T细胞反应性的体外方法的发展主要集中在淋巴细胞变形试验（LTT）。LTT能检查PPD抗原的抗原特异性。若是把它看作结核菌素试验的一种替代试验，则有几个缺点：①需要从全血中分离淋巴细胞，这种技术耗时且能被检查的动物的数量非常有限；②需要在复合组织培养介质中培养这些细胞3 d～5 d；③需要用放射核酸技术检测细胞增殖水平。?

淋巴细胞的分离要受到用组织培养介质稀释全血样品的限制，但还有其他的限制的存在。这些条件意味着，如果淋巴细胞增殖试验对研究有意义，那么将其作为结核菌素试验的一种实用的替代方法无疑太复杂、太昂贵而且太慢了。因而，发现了一种迅速的全血培养系统，检查一种细胞因子——γ干扰素的释放，作为牛结核分支杆菌抗原（PPD）的阳性反应的指示剂^[12]。?

由T淋巴细胞和NK细胞产生的细胞因子γ干扰素对巨噬细胞的活性是很关键的， 且在介导细胞免疫中扮演着关键性角色。通过研究人淋巴细胞表明，记忆性T细胞有产生γ干扰素的潜力，但原始T细胞有削减细胞因子产生的能力^[13]。结核分支杆菌的ESAT-6是免疫记忆效应T细胞的主要靶抗原之一，可在再次感染的早期诱导其迅速增殖并释放高水平的γ干扰素，有效激活巨噬细胞，从而控制结核病^[14]。?

一种检测γ干扰素存在的生物学试验证实了γ干扰素与从淋巴细胞增殖试验得到的结果有很好的相关性。因此，研制重组牛γ干扰素的单克隆抗体，并用这些单克隆抗体开发了一种对牛γ干扰素敏感的酶免疫试验（EIA）。牛γ干扰素EIA一旦与全血培养系统相结合，就可产生一种特异、快速（24 h）和敏感的体外检测牛分支杆菌感染牛的特异性细胞免疫反应。加肝素的全血等分试验加入PPD一起培养16 h~24 h后，作γ干扰素EIA^[15]。假阳性反应的出现归因于所用的抗原样品的交叉反应性。通过使用对照试验可以在很大程度上得到克服假阳性，可在试验中设动物对牛PPD和禽PPD的γ干扰素反应的对照。?

在1989年-1990年间，澳大利亚在较广范围内对γ干扰素试验和SIDT进行了比较。对非结核感染区的6 000头牛试验后得出γ干扰素的特异性（96.3%）。从已知感染牛结核的牛群中抽出6 264头，用两种试验方法进行检查后证实了这两种方法的敏感性数值，结果经培养后确定了有125头感染了牛结核。γ干扰素试验表现出93.6%的敏感性，而结核菌素试验敏感性只为65.6%。而将γ干扰素和结核菌素试验同时应用，则可获得最大敏感性为95.2%。暴露于结核暴发区的动物，28头γ干扰素阳性牛中有16头也是抗体阳性。尤其是12头γ干扰素阳性，SIDT阴性牛中有7头对TB蛋白表现出抗体反应^[16]。?

在γ干扰素试验的早期试验期间就发现了细胞反应和体液反应的不同。多数牛MPT70-ELISA阳性，而对γ干扰素试验和结核菌素试验为阴性。Ritacco等同样发现了自然感染牛分支杆菌的牛细胞反应（γ干扰素）和体液反应之间存在负相关。?

γ干扰素试验优于结核菌素试验的一个特点就是，动物不会因为没有抗原进入体内而被延迟检查，且可重复检查。Radunz和Lepper发现结核菌素试验在60 d内可限制接下来的试验，因而牛在此段时间内不能再被检查。Rothel J S等发现感染牛分支杆菌的牛的结核菌素试验也影响了动物的γ干扰素反应，结核菌素试验后，紧接着就可发现7 d内γ干扰素反应下降，然后逐渐提高，至少可持续60 d ^[17]。相对来说，牛对禽的PPD的相对反应相差不大，且该动物在整个实验过程中被看作是一个反应器。?

在澳大利亚，γ干扰素试验已被农业委员会确认为牛结核的诊断试验。γ干扰素试验方法也可用于其他牛病。γ干扰素可以以同等敏感性检测出临床和亚临床潜伏期的副结核病感染的牛。γ干扰素EIA由CSL有限商业化生产，γ干扰素EIA的跟踪试验在美国，新西兰和爱尔兰正在进行中。从爱尔兰得到的初步结果表明，γ干扰素试验有89.5%的敏感性和98.5%的特异性。?

3 免疫反应的基因多样性?

为了克服血清学试验中粗制分支杆菌制剂的抗原交叉反应性，已经确认了几个群，而且已分离了牛分支杆菌的几种特异性蛋白质。从牛分支杆菌的特异性的观点来说，两种蛋白（MPB64和MPB70）已较早被确认。但是，更深入的检查后发现这些蛋白不完全对牛分支杆菌特异性，而且对牛分支杆菌非感染动物和其他分支杆菌感染的动物的血清可呈现假阳性反应。Harboe M等报道了用星状诺卡菌素免疫兔，发现它的血清与MPB70有交叉反应，但这种蛋白与牛血清有交叉反应的原因还不清楚^[18]。但已经发现一些经结核菌素皮试的牛对MPB70有较高的抗体效价。抗酸染色的病原菌难培养已在典型结核中发现，该情况主要是因为非特异性的结核菌素产生的。?

虽然应用了各种方法来描绘牛分支杆菌的这些蛋白的特异抗原表位，把这些多肽用于诊断牛结核病不可能有实用价值，因为牛群体杂交的免疫反应的多样性。对人和小鼠研究表明，特殊分支杆菌抗原所引起的免疫反应与动物参与的基因背景不同。Fifis等发现从牛分支杆菌感染牛得到的个别血清的反应性和与一种宽范围的纯化牛分支杆菌蛋白的反应性不同。Wood P R等表示，用PPD作为抗原进行γ干扰素试验检测出的18头阳性牛，若只用MPB70作为惟一的抗原，那么18头牛分支杆菌感染牛中将有7头被漏掉。因此，如果一种血清学或细胞学试验既有很高的敏感性又获得了很高水平的特异性，那么牛分支杆菌的几种特异性抗原的使用就不必要了，因为牛结核的更多的诊断试验的最终目标是在畜群中彻底根除该病，一种牛分支杆菌特异性抗原的使用可能导致敏感性的降低，将是难以接受的。?

4 展望?

γ干扰素试验的发展是牛结核病诊断的一个主要发展趋势。在澳大利亚，γ干扰素试验已被确认为自20世纪结核菌素试验问世以来诊断牛结核病的最新诊断试验方法^[19]。起先，该试验被用于疑似畜群的诊断，在人们熟悉了该试验方法后，其才被广泛接受和应用。?

虽然一个动物用γ干扰素方法检测的单位价格要比结核菌素法高，但是它的高敏感性意味着根除畜群中结核病需要较少轮的检查即可，故从一个畜群根除牛结核的总费用实际上应该是降低了。抗原交叉反应仍是一个主要问题，除非能确认高百分比的牛分支杆菌感染的牛能识别一系列的牛分支杆菌特异性抗原表位，否则仍需要对照试验。牛结核病血清学试验的特异性通过与纯化蛋白结合得到了很大提高，但是血清学试验的低敏感性归因于分支杆菌感染引起的基础免疫生理学，且是细胞反应而不是体液反应占主导。