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核酸探针技术


化学及生物学意义上的探针(probe),是指与特定的靶分子发生特异性相互作用,并可被特殊的方法探知的分子。抗体—抗原、生物素—抗生物素蛋白、生长因子—受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。
  核酸探针技术原理是碱基配对。互补的两条核酸单链通过退火形成双链,这一过程称为核酸杂交。核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段,它能和与其互补的核酸序列杂交,形成双链,所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。每一种病原体都具有独特的核酸片段,通过分离和标记这些片段就可制备出探针,用于疾病的诊断等研究。

  (一)核酸探针的种类
  1.按来源及性质划分 可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。
  作为诊断试剂,较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。其中,前者应用最为广泛,它的制备可通过酶切或聚合酶链反应(PCR)从基因组中获得特异的DNA后将其克隆到质粒或噬菌体载体中,随着质粒的复制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的DNA探针。将RNA进行反转录,所获得的产物即为cDNA。cDNA探针适用于RNA病毒的检测。cDNA探针序列也可克隆到质粒或噬菌中,以便大量制备。
  将信息RNA(mRNA)标记也可作为核酸分子杂交的探针。但由于来源极不方便,且RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解,操作不便,因此应用较少。
用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核酸杂交探针应用十分广泛,可根据需要随心所欲合成相应的序列,可合成仅有几十个bp的探针序列,对于检测点突变和小段碱基的缺失或插入尤为适用。
  2.按标记物划分 有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。放射性标记探针用放射性同位素做为标记物。放射性同位素是最早使用,也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的同位素32P、3H、35S。其中,以32P应用最普遍。放射性标记的优点是灵敏度高,可以检测到Pg级;缺点是易造成放射性污染,同位素半衰期短,不稳定,成本高等。因此,放射性标记的探针不能实现商品化。目前,许多实验室都致力于发展非放射性标记的探针。
  目前应用较多的非放射性标记物是生物素(biotin)和地高辛(digoxigenin)。二者都是半抗原。生物素是一种小分子水溶性维生素,对亲和素有独特的亲和力,两者能形成稳定复合物,通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。地高辛是一种类固醇半抗原分子,可利用其抗体进行免疫检测,原理类似于生物素的检测。地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标记的相当,而特异性优于生物素标记,其应用日趋广泛。


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