( 3 )固定液量要充足,一般要 20 倍于组织的量,量太少会造成固定液浓度降低。
( 4 )组织固定后应充分水洗,去除固定液,以减少固定液造成的人为假象。固定时间最好以完全浸透为宜( 12h~72h ),固定时间过久可能会影响染色效果。
(四)组织的脱水、透明、浸蜡
做石蜡切片的组织需经固定、脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋,才能制备出薄片。整个操作过程中要掌握的原则是:脱水透明要够而不过,浸蜡的温度不宜超过 64 ℃ ,否则一是可能使抗原活性下降,降低检出率,另外还可能造成组织焦脆,焦脆的组织切片困难,即使勉强切下来了,染色过程中也极易脱片,且染色效果不好。具体程序如下:
组织脱水、透明、浸蜡程序
液缸号液体种类处理时间处理温度脱
水170%酒精2小时室温 280%酒精2小时室温 390%酒精2小时室温 4无水酒精2小时室温 5无水酒精2小时室温 6无水酒精3小时室温 7无水酒精3小时室温 透
明8二甲苯或氯仿 1小时室温 9二甲苯或氯仿1小时室温 10二甲苯或氯仿1小时室温 浸
蜡11石蜡30分60℃12石蜡30分60℃13石蜡30分60℃14石蜡30分60℃
从蜡缸拿出后用石蜡进行包埋。
(五)切片1.载玻片的预处理 载玻片的处理是做好免疫组化染色的重要步骤,尤其对一些需做酶消化、微波或高压处理、 PCR 扩增的组织切片更为重要,目前常用的防脱片剂有以下几种:
( 1 ) APES ( 3- 氨丙基三乙氧硅烷) 它可以和组织、玻片上的氢键形成共价键。用甲醇 / 丙酮配成 2% 浓度使用。 APES 使用方便,便于大量应用,且价格便宜。
( 2 ) 1% 铬明矾明胶
( 3 )白胶
( 4 )多聚左旋赖氨酸 粘贴较紧,可用于多种组织化学、原位核酸分子杂交等。但其价格较贵。
2.切片
用石蜡切片机将包埋有组织的蜡块切成薄片,切片厚度一般 3—5μm ,除脑组织等细胞量较少的组织外,切片要尽可能薄, 45 ℃ 水温展片,要尽量展平,否则皱褶处易出现非特异染色。 55~60 ℃ 温箱烤片 2 小时,防水密封,低温保存备用。
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来源:互联网
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