2 结果与讨论
2.1 bGRF类似物基因的设计 为便于该基因的克隆及多拷贝基因的构建，在编码基因两侧设Nde I、Bgl II、BamH I和EcoR I酶切位点，其中Bg1 II和BamH I能产生相同的粘性末端。同时在基因两侧各设一个编码Met的ATG密码子这有利于表达产物后处理。BamH I切点后面设计两个连续的终止密码子TAG、TAA。基因两侧各设两个保护碱基AC和CG。设计的bGRF类似物基因全序列如图l所示，基因的长度为141碱基，编码基因81碱基(图中虚线为片线A、B，实线为编码基因)。
2.2 bGRy类似物基因的合成 确定了bGRF类似物基因的序列后，设计合成了3’末端有19碱基互补的80碱基的片段A、B两个寡核苷酸片段。并互为模板引物通过酶促延伸得到目的基因双链。这和国内报道的首先合成几个彼此互补的寡核昔酸片段，再拼接成完整基因相比简单。但是要求两寡核苦酸片段尽可能纯，否则酶促补齐得不到特异的DNA片段。
2.3 bGRF类似物基因的克隆和测序 小量抽提20个重组白色茵落，并按1.2.4方法进行酶切分析，0.8％琼脂糖凝胶电泳，其中3个白色菌落的重组质粒均能被Bg1 II、EcoR I、BamH I切开成一条带。用Nde I／EcoR I双切的小片段与我们设计的基因片段大小相符。取其中一个酶切分析符合条件的重组质粒克隆于pUC18中，通过双脱氧终止法，使用AB1377全自动荧光测序仪进行测序。测序结果证明，所得目的基因与设计的一致，该重组质粒命名为pUC-GRF。
2.4 多拷贝基因的构建 质粒pUC-GRF用Aat II/Bg1 II酶双切产生的大片段和Aat II/BamH I酶双切产生的小片段连接后转化大肠杆菌JMl09，经小量抽提酶切鉴定得到含有2拷贝基因的质粒，按同样方法可得4、8、16等多拷贝基因，制备过程如图2（略）。把已得到的多拷贝基因经Hind III/BamH I双切(含不同拷贝基因片段大小为l02N+70，N：代表基因的拷贝数)，pBR322/Hinf为分子量对照，2％琼脂糖电泳，如图3（略）。然后把16拷贝基因连到PBV220表达载体中，该重组体命名pBV-16GRF。
2.5 基因的表达及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 按1.2.6方法电泳，结果表明重组菌株经温度诱导后电泳显示在66kD加略前方有一条蛋白带，这一蛋白带与理论上表达产物的分子量(64KD)相符，而受体菌DH_5α和没有经诱导的重组菌株没有显示这一蛋白带，如图4略(箭头处为重组菌表达的蛋白带)。
本文设计bGRF类似物基因的长度为14l碱基，编码基因部分只有81碱基。目前国内对小片段基因的表达，一般采用融合基因的形式来表达。而本实验是采用将bGRF类似物基因串连成多拷贝，整个基因具有正确的阅读框架，然后用pBV-220载体表达非融合蛋白。同时每个编码基因的两侧都设有一个编码Met的密码子，这样有利于表达产物可以利用BrCN特异切割多聚体得到单体bGRF类似物。下一步工作将深入研究不同拷贝数基因对表达效果的影响，高效表达工程菌的筛选、鉴定以及bGRF类似物的分离、纯化。
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收稿日期：1999-03-15
基金项目：山东省科委资助项目
作者简介：高运东(1972-)，男，山东莒县人，研实，学土，从事分子遗传学研究。