高运东1，仲脐峰1，王文英1，王庆国1，马世援1，冯敏燕2
(1．山东省农业科学院生物技术研究中心，济南250100；2．山东省金泰集团)
搞 要：本研究以近期报道的高生物学活性、高代谢稳定性的牛生长激素释放因子类似物(Ile2，Ala15，Leu27)bGRF(1-29)-NH2的氨基酸序列为模板，选用大肠杆菌高效表达所偏爱的密码子设计出该基因的全序列。采用化学合成法合成两个3'末端有19碱基互补的80碱基的寡核苷酸片段。并互为模板和引物，通过酶促延伸合成完整的bGRF类似物基因，克隆于pT7 B1ue T-Vector中，通过蓝／白筛选和酶切分析确定了阳性克隆。然后将目的基因从P，n B1ueT—v6ctor克隆于pUC18载体中，以便多拷贝基因的制备。通过测序证明我们获得了目的克隆。将目的基因首尾串联，制备得到的16拷贝基因在温控启动子PRPL调控下于大肠杆菌中获得表达。
关键词：bGRF类似物基因；化学合成；克隆；表达
中图分类号：S813 文献标识码：A 文章编号：0366-6964(2000)04-0296-05
生长激素释放因子(GRF)是脊椎动物下丘脑中的一种能特异性诱导脑垂体前叶细胞合成与分泌生长激素(GH)的多肽激素。1982年Guillemin[1]等人首先从肢端肥大症患者的胰异位肿瘤中分离到人肿瘤GRF，随后又从人的下丘脑中分离到这种物质，并对其进行了分析和鉴定。研究表明，这两种不同来源的GRF有相同的理化性质和一级结构，都是由44个氨基酸组成。
GRF对脊椎动物的生长、发育以及代谢调控起着极其重要的作用，其主要功能是诱导并刺激垂体合成与分泌生长激素[1]。动物实验表明[2、3]，给动物静脉注射适量的GRF或其类似物，可以诱导不同动物GH分泌水平的提高，引起一系列生理生化反应。因而，获得大量GRF及其高生物学活性和代谢稳定性的GBF类似物成了令人感兴趣的课题。但靠提取天然的bGRF很难满足科研生产需要，近年来国外先后报道了利用基因工程生产GRF的方法[4、5]，国内也有类似的报道[6、7]。国外文献报道[8、9、10](I1e2，Ala15，Leu27)bGRF(1-29)-NH2在牛体内促进释放GH的能力比天然的bGRF(1-44)-NH2高5倍，是目前生长激素释放因子类似物中活性最强的一种。本实验通过人工合成bGRF类似物基因，制备多拷贝基因，在温控启动子PRPL调控下在大肠杆菌中表达。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种和质粒：E.coli JM109 DH5α及质粒pUCl8、pT7 Blue T-Vector载体均为本实验室自备。pBV220(哈尔滨兽医研究所提供)为表达载体见文献[11]。
1.1.2 酶及试剂：各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA 聚合酶、dNTPs、低熔点琼脂糖均为Promega公司产品；蛋白胨和酵母粉为OXOID公司产品；DNA分子量参照物购自华美生物工程公司；其它化学试剂为进口或国产分析纯产品。片段A、B为本实验室设计，大连生物工程公司合成(如图1略)。
1.2 方法
1.2.1 质粒DNA的制备与纯化、酶切、连接、转化以及DNA的回收、感受态的制备：均参照文献[12]并稍做改动。
1.2.2 目的基因的酶促合成及其克隆：片段A、B各lμg、10×Buffer(含25mm01儿M8C12)10μl、dNTPs(2.5mmol/L)8μl、3UTaq酶加水至100μl，混匀，94℃5min、55℃5min、72℃2min。低溶点琼脂糖回收的目的片段与pT7 Blue T-Vector按摩尔数3：1进行连接反应，连接产物转化JM109。
1.2.3 重组质粒的分析：通过蓝／白筛选得到的白色重组菌落，进行小量抽提。首先用目的基因中含有而载体中没有的单一切点Bgl II酶切，切开后再采用BaMHI、EcoRI酶单切、NdeI/EcoR I酶双切，建立酶切图谱，筛选阳性克隆。取上述检测正确的重组质粒，将目的片段克隆于pUC18载体中的EcoR I/Hind III位点处测序。
1.2.4 多拷贝基因的制备及与表达载体的连接：通过酶切回收将基因首尾串联成多拷贝基因。pUC-l6GRF用Bg1 II酶切、K1enow酶补平、再用BamH I酶切回收基因片段和pBV 220经EcoR I酶切、Klenow酶补平、BamH I酶切回收载体通过粘一平端连接，转化DH5α。
1.2.5 pBV-16GRF重组质粒在大肠杆菌DH5α中的表达及SDS聚丙烯酰胺凝胶鉴定：含
pBV-16GRF质粒的DH5α30℃培养过夜，按1：50稀释转入LB培养液中，30℃下振荡培养2h，然后42℃诱导表达4h。取1.5ml培养物得到的菌体悬浮于50μl 1×SDS凝胶加样缓冲液中，100℃加热3min后，离心取上清35μl，在12％SDS-PAGE进行电泳分析。
2 结果与讨论
2.1 bGRF类似物基因的设计 为便于该基因的克隆及多拷贝基因的构建，在编码基因两侧设Nde I、Bgl II、BamH I和EcoR I酶切位点，其中Bg1 II和BamH I能产生相同的粘性末端。同时在基因两侧各设一个编码Met的ATG密码子这有利于表达产物后处理。BamH I切点后面设计两个连续的终止密码子TAG、TAA。基因两侧各设两个保护碱基AC和CG。设计的bGRF类似物基因全序列如图l所示，基因的长度为141碱基，编码基因81碱基(图中虚线为片线A、B，实线为编码基因)。
2.2 bGRy类似物基因的合成 确定了bGRF类似物基因的序列后，设计合成了3’末端有19碱基互补的80碱基的片段A、B两个寡核苷酸片段。并互为模板引物通过酶促延伸得到目的基因双链。这和国内报道的首先合成几个彼此互补的寡核昔酸片段，再拼接成完整基因相比简单。但是要求两寡核苦酸片段尽可能纯，否则酶促补齐得不到特异的DNA片段。
2.3 bGRF类似物基因的克隆和测序 小量抽提20个重组白色茵落，并按1.2.4方法进行酶切分析，0.8％琼脂糖凝胶电泳，其中3个白色菌落的重组质粒均能被Bg1 II、EcoR I、BamH I切开成一条带。用Nde I／EcoR I双切的小片段与我们设计的基因片段大小相符。取其中一个酶切分析符合条件的重组质粒克隆于pUC18中，通过双脱氧终止法，使用AB1377全自动荧光测序仪进行测序。测序结果证明，所得目的基因与设计的一致，该重组质粒命名为pUC-GRF。
2.4 多拷贝基因的构建 质粒pUC-GRF用Aat II/Bg1 II酶双切产生的大片段和Aat II/BamH I酶双切产生的小片段连接后转化大肠杆菌JMl09，经小量抽提酶切鉴定得到含有2拷贝基因的质粒，按同样方法可得4、8、16等多拷贝基因，制备过程如图2（略）。把已得到的多拷贝基因经Hind III/BamH I双切(含不同拷贝基因片段大小为l02N+70，N：代表基因的拷贝数)，pBR322/Hinf为分子量对照，2％琼脂糖电泳，如图3（略）。然后把16拷贝基因连到PBV220表达载体中，该重组体命名pBV-16GRF。
2.5 基因的表达及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 按1.2.6方法电泳，结果表明重组菌株经温度诱导后电泳显示在66kD加略前方有一条蛋白带，这一蛋白带与理论上表达产物的分子量(64KD)相符，而受体菌DH5α和没有经诱导的重组菌株没有显示这一蛋白带，如图4略(箭头处为重组菌表达的蛋白带)。
本文设计bGRF类似物基因的长度为14l碱基，编码基因部分只有81碱基。目前国内对小片段基因的表达，一般采用融合基因的形式来表达。而本实验是采用将bGRF类似物基因串连成多拷贝，整个基因具有正确的阅读框架，然后用pBV-220载体表达非融合蛋白。同时每个编码基因的两侧都设有一个编码Met的密码子，这样有利于表达产物可以利用BrCN特异切割多聚体得到单体bGRF类似物。下一步工作将深入研究不同拷贝数基因对表达效果的影响，高效表达工程菌的筛选、鉴定以及bGRF类似物的分离、纯化。
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收稿日期：1999-03-15
基金项目：山东省科委资助项目
作者简介：高运东(1972-)，男，山东莒县人，研实，学土，从事分子遗传学研究。
