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猪传染性胸膜肺炎和多发性关节炎及浆膜炎混合感染



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3 病理变化 鼻黏膜肿大、出血,有黏液流出;扁桃体肿大、充血和溃疡;气管内有大量渗出液。肺脏呈紫黑色或暗黑色变化、水肿、充血,表面出现灰白色的脓灶,胸腔积液,肺脏与心包,膈膜,胸腔壁粘连。胸膜出现黏液性和化脓性的

渗出物。?

4 病原分离与鉴定

4.1 病原分离 无菌取濒死猪肺、咽喉扁桃体和关节液,接种到含NAD的PPLO琼脂培养基上,置10% CO237℃培养箱中培养24h,观察到直径0.5~2mm透明的菌落。进一步纯化培养。

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4.2 涂片镜检 取上述菌抹片,革兰氏染色镜检,可见到两种不同的细菌。?

4.3 二联PCR扩增反应 因怀疑上述两种细菌为APP和HPS,故用APP-HPS二联PCR进行鉴定。

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4.3.1 模板的制备 从纯化的菌落中挑取数个菌落于一含30μl无菌水的EP管中,100℃沸水中煮5~10min,立即放入冰水混合物中,待完全冷却后,10 000 r/min离心3min,取上清液做模板。

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4.3.2 反应体系条件10倍缓冲液5μl,25mmol/L MgCl2 3μl,2mmol/LdNTPs 1.5 μl,两对引物(1.5 μlmol/L)各1.5 μl,Taq DNA酶0.5μl,模板10μl,补无菌水至50μl。扩增时先94℃预变性4min,然后按94℃ 40s,58℃ 40s,72℃40s的循环程序进行35次循环,最后一个循环结束后再延伸10min。

4.3.3 PCR产物鉴定 取PCR产物于含EB的0.8%琼脂糖胶中电泳,紫外线灯下观察分析,预期扩增的是422 bp(APP)和822 bp(HPS)大小的两条片段。

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4.3.4 动物实验 将12只健康小鼠随机分为3组(每组4只),一组腹腔注射无菌的PPLO液体培养液(对照组),另两组分别气管内接种两种用液体培养好的菌液(浓度为1×109 CFU/ml),每只注射2ml。饲养于已1周前消毒的动物房中,观察30天。

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4.3.5 生化试验 按文献对分离的细菌进行相应的生化试验。?

5 药敏试验 用于试验的药物有先锋霉素、氯霉素、环丙沙星、红霉素、痢特灵、强力霉素、庆大霉素、卡那霉素、青霉素、氟哌酸、氨苄青霉素、四环素。?

6 结果

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6.1 涂片镜检 从病料中分离到两种革兰氏阴性细菌,一种直径约1~1.5 mm短小球杆菌,一种为直径约为0.5mm的短杆菌。?

图1 待检样品中胸膜肺炎放线杆菌PCR检测结果(略)

1.阴性对照;2.阳性对照;3~5.待检样品; 分子量标准(DL2 000)

6.2 二联PCR鉴定结果 从图1中可以看出,3个待检样品中一个扩增出422 bp大小的条带,另一个扩增出821 bp大小的条带。

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6.3 动物实验结果 4只注射APP菌液小鼠在?24~36h内全部急性死亡。4只注射HPS菌液小鼠中在48h内死亡。死亡小鼠外表无明显变化,剖检见到与自然发病相同的变化。取肺和关节液涂片镜检可见与自然发病形态相同的菌体,对照组没有明显的变化。

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6.4 生化鉴定结果见表1。

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6.5 药敏试验结果 疑似APP的菌株对先锋霉素、氯霉素、环丙沙星敏感;对氟哌酸、氨苄青霉素、四环素耐药。〖KG*2〗疑似HPs的菌株对先锋霉素、 环丙沙星和氟哌酸敏感;对氨苄青霉素、四环素耐药。?


7 小结


从图1中可以看出,3份样品中有一份是APP阳性,一份是HPS阳性,结合形态染色、培养特征、生化鉴定及动物实验,因此可以认为本次疾病是猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌混合感染所致。



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