猪传染性胸膜肺炎和多发性关节炎及浆膜炎混合感染

加入收藏饲养管理 2006-01-16 [打印] 青霉素细菌氟哌酸环丙沙星

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某现代化集约化猪场2暴发了一场以呼吸困难、跛行、体表和四肢发绀为主要症状的传染病，从其病料中分离两株菌株，经鉴定为胸膜肺炎放线杆菌（APP）和副猪嗜血杆菌（HPS）。报告如下。?

1 发病情况该场为出栏5 000头的规模猪场，存栏肥猪和保育肥猪2 051头，4月份发病89头（4.3%），死亡33头（2.1%）。

2 临床症状猪精神委靡，食欲减退，呼吸困难，被毛粗乱，发绀，消瘦，犬坐式，腹式呼吸，有的关节肿大，跛行，站立不稳，病程可达2～3周。

3 病理变化鼻黏膜肿大、出血，有黏液流出；扁桃体肿大、充血和溃疡；气管内有大量渗出液。肺脏呈紫黑色或暗黑色变化、水肿、充血，表面出现灰白色的脓灶，胸腔积液，肺脏与心包，膈膜，胸腔壁粘连。胸膜出现黏液性和化脓性的

渗出物。?

4 病原分离与鉴定

4.1 病原分离无菌取濒死猪肺、咽喉扁桃体和关节液，接种到含NAD的PPLO琼脂培养基上，置10% CO237℃培养箱中培养24h，观察到直径0.5～2mm透明的菌落。进一步纯化培养。

4.2 涂片镜检取上述菌抹片，革兰氏染色镜检，可见到两种不同的细菌。?

4.3 二联PCR扩增反应因怀疑上述两种细菌为APP和HPS，故用APP-HPS二联PCR进行鉴定。

4.3.1 模板的制备从纯化的菌落中挑取数个菌落于一含30μl无菌水的EP管中，100℃沸水中煮5～10min，立即放入冰水混合物中，待完全冷却后，10 000 r/min离心3min，取上清液做模板。

4.3.2 反应体系条件10倍缓冲液5μl，25mmol/L MgCl2 3μl，2mmol/LdNTPs 1.5 μl，两对引物（1.5 μlmol/L）各1.5 μl，Taq DNA酶0.5μl，模板10μl，补无菌水至50μl。扩增时先94℃预变性4min，然后按94℃ 40s，58℃ 40s，72℃40s的循环程序进行35次循环，最后一个循环结束后再延伸10min。

4.3.3 PCR产物鉴定取PCR产物于含EB的0.8%琼脂糖胶中电泳，紫外线灯下观察分析，预期扩增的是422 bp（APP）和822 bp（HPS）大小的两条片段。

4.3.4 动物实验将12只健康小鼠随机分为3组（每组4只），一组腹腔注射无菌的PPLO液体培养液（对照组），另两组分别气管内接种两种用液体培养好的菌液（浓度为1×109 CFU/ml），每只注射2ml。饲养于已1周前消毒的动物房中，观察30天。

4.3.5 生化试验按文献对分离的细菌进行相应的生化试验。?

5 药敏试验用于试验的药物有先锋霉素、氯霉素、环丙沙星、红霉素、痢特灵、强力霉素、庆大霉素、卡那霉素、青霉素、氟哌酸、氨苄青霉素、四环素。?

6 结果

6.1 涂片镜检从病料中分离到两种革兰氏阴性细菌，一种直径约1～1.5 mm短小球杆菌，一种为直径约为0.5mm的短杆菌。?

图1 待检样品中胸膜肺炎放线杆菌PCR检测结果（略）

1.阴性对照；2.阳性对照；3～5.待检样品；分子量标准(DL2 000)

6.2 二联PCR鉴定结果从图1中可以看出，3个待检样品中一个扩增出422 bp大小的条带，另一个扩增出821 bp大小的条带。

6.3 动物实验结果 4只注射APP菌液小鼠在?24～36h内全部急性死亡。4只注射HPS菌液小鼠中在48h内死亡。死亡小鼠外表无明显变化，剖检见到与自然发病相同的变化。取肺和关节液涂片镜检可见与自然发病形态相同的菌体，对照组没有明显的变化。

6.4 生化鉴定结果见表1。

6.5 药敏试验结果疑似APP的菌株对先锋霉素、氯霉素、环丙沙星敏感；对氟哌酸、氨苄青霉素、四环素耐药。〖KG*2〗疑似HPs的菌株对先锋霉素、环丙沙星和氟哌酸敏感；对氨苄青霉素、四环素耐药。?