以1.8M二醇或1.6丙二醇作抗冻剂冷冻牛胚胎，解冻后在M－PBS中一步脱除抗冻体外培养或不脱除抗冻剂直接移植给受母牛。结果表明用1.8M乙二醇直接移植法的体外培养存活率和移植妊娠率均显著高于1.6M丙二醇组，分别为84.8%比65.5%和48.5%比40.0%（P<0.05），但与对照组（1.4M甘油常规法）之间无显著差异，分别为84.8%比86.7%和48.5%比50.0%（P＞0.05）。

关键词：牛 冷冻胚胎 直接移植法

牛冷冻胚胎解冻后能直接移植给受体牛的胚胎冷冻保存方法，对在商业条件下应用胚胎移植技术最有价值。传统冷冻法通常在胚胎解冻后用蔗糖溶液分步脱除搞冻剂后方能移植，而直接移植法简化了移植前胚胎的处理，不公可消除由于脱去搞冻剂所带来的技术误差，而且操作简便、省时、不需专门设备与器械，就象细管冷冻精液输精一样，胚胎解冻后可立即移植。实现上述目的的关键问题是寻求一种对胚胎具有渗透性高的抗冻剂，以使胚胎解冻后直接复水，并获得较高的活力。为此，有人曾选用甘油和蔗糖混合液一步解冻（Massip等，1984），又有人用丙二醇（SuzuKi等，1992）作为抗冻剂冷冻牛胚胎，解冻后直接在PBS中复水脱除抗冻剂。阳年生等（1996）对胚胎一步脱除抗冻剂的冷冻方法也进行了深入的试验研究。然而，到目前止，大多数研究采用的是牛体外受精胚胎，在国内善于体骨受精的胚胎用不同抗冻剂冷冻－解冻后直接移植的效果迄今报道少见。本研究目的是确定乙二醇或丙二醇作为抗冻保护剂冷冻－－解冻牛体内膛胎进行体外培养，以及在生产条件下直接移植的效果。

　　1 材料与方法

　　1.1 胚胎体内生产

试验以天津市奶牛育种站饲养的荷斯坦泌乳母牛为供体。自然发情后第9～13天用高活必FSHP（中国科学院动物研究所研制）配合PG（上海计划生育研究所生产）进行超数排卵处理。超排发情后间隔10～12小时以美国、加拿大纯种公牛细管冻精输精2～3次。授精后第7或第8天用全封闭自动冲卵装置（FHK，日本，富士平工业公司）进行非手术采卵。回收的冲卵液经经孔径为0.75微米的胚胎过滤器滤过后，将少量残液置于20～40倍实体显微镜下检出胚胎，在NiKon倒置镜下按形态学分类法评定胚胎品质。选择A级或B级紧缩桑椹胚或囊胚用于冷冻试验。

　　1.2 胚胎在含20％FCS（胎犊血清）的M－PBS液中清洗3次后分别按下述冷冻和解冻方法处理。（1）直接移植法：按2种抗冻剂分组：①组为1.8M乙二醇（EG）；②组为1.6M丙二醇（PD）。在室温下将胚胎一步移入1.8M乙二醇＋M－PBS＋20％FCS或1.6M丙二醇＋M－PBS＋20％FCS的冷冻液中，随后装入0.25毫升塑料细管，胚胎在冷冻液中至上机冷冻前的平衡时间为10～20分钟。在－7℃，将胚胎直接放入程控冷冻仪（ET－1型，FHK，富士平工业公司）的洒精浴槽内，2分钟后植冰，在－7℃下停留8分钟。然后以0.3℃／分的速率降温至－30℃，取出胚胎细管，直接投入液氮中保存。解冻时，从罐中取出细管在空气中停留5～10秒钟后，浸入30℃水浴中（见冰晶消失为止），然后将胚胎直接注入含M－PBS＋20％FCS液的皿内，15分钟后用该液清洗2次。

　　（2）常规法（对照组）：使用的抗冻剂为1.4M甘油（Gly）。在室温下将胚胎分步移入0.5M、1.0M和1.4M甘油＋M－PBS＋20％FCS的冷冻液中，每步停留10分钟。然后将胚胎移入1.4M甘油冷冻液中停留10分钟。然后将胚胎装入1.4M甘油冷冻液停留10分钟后装入细管内。在－5.3℃，将胚胎直接放入冷冻仪内，植冰与降温等程序均与1法相同。在37℃水浴中解冻后，将胚胎依次移入1.0M甘油+0.3M蔗糖、0.5M甘油＋0.3M蔗糖和0.3M蔗糖＋M－PBS＋20％FCS的解冻液中分步脱除抗冻剂每步停留10分钟。最后用M－PBS＋20％FCS液清洗2次。

　　1.3 体外培养与膛胎存活力评定将脱除抗冻剂的各组胚胎移入预先覆盖矿物油的TCM－199＋20％FCS培养小滴中，置CO₂培养箱（温度：38℃；CO₂：5％）内培养24～48小时，发育至下一阶段且形态好的胚胎判为存活胚胎。

　　1.4 移植及妊娠诊断：受体来自静海县奶类项目办实验牛场和市奶牛发展中心饲养的荷斯坦良成母牛及部分成年母牛。选择自然发情或经PG处理后同期发情、生殖器官无异常、黄体发育良好的母牛作受体。和直接移植法和常规法冷冻保存数日的胚胎携农场解冻后分别做如下处理：前者不脱除搞冻剂，直接移植；后者分步脱除抗冻剂后，按常规操作非手术移植到子宫角深部。移植后60～90天通过直肠检查诊断妊娠。