(2）稀释方法 甘油是牛精液冷冻保存的重要保护剂，但它对精子同时也具有性。为减低甘油对精 子的有害作用，多采用两次稀释，即采精后先用不含甘油的 第一液稀释到最终稀释倍数的一半，经缓慢降温（不少于60分钟）至4～5℃的温度 下，再加入同温等量含甘油的第二液。第二液的加入方法有一次或多次加入，以及 缓慢滴入等方法。甘油的最终浓度通常为7％。 近年来，在试验的基础上，我国有的采用一次稀释的方法。即采精后用同温 的含甘油稀释液一次稀释完成，也取得了良好的冷冻保存效果。

（三）、精液的低温平衡 平衡是指精液加入含甘油的稀释液后，需在4～5℃的条件下放置的时间。在 此之前，首先要把采精后稀释的精液缓慢降温至4～5℃。具体做法是：将装精液的 容器外面包以纱布、棉花，或放入同温的水中，再放入0～5℃的冰箱中，经1 小时即可达到降温的目的。 牛精液在冷冻前各国采用的平衡时间差异较大，我国一般在2～4小时。

（四）、精液分装和冻结

（1）分装牛精液在冷冻前可采用玻璃安瓿、塑料细管和颗粒3种分装方法。 目前应用较多的是后面两种，并且细管法日渐增多。颗粒法虽有容积小、操作简单、 成本低、快速冻结效果好等优点，但存在着不易标记、易破损和污染以及解冻再稀 释等问题。 细管法具有卫生条件好、容积小、可快速冷冻、精子损耗少，、易标记和适 于机械化生产等优点。到目前为止，我国仍多采用颗粒法冷冻，但已逐步向细管法 过渡。 精液分装前，塑料细管要用打印机作好有关标记（公牛号、品种、生产日期 等），并在紫外线灯下照射消毒。 分装是用专门的机械进行的，分装后即可放入0～5℃的。冰箱缓慢降温和平 衡，时间与颗粒法相似。 冻结时，将平衡后的细管平放在纱网上，放置在距离液氮面2～3厘米处，停 留7～8分钟，随后浸入液氮。经抽样检查合格后，即可按一定包装规格包装并在液 氮中长期保存。

（2）冻结 牛精液冷冻的冷源普遍应用液氮。颗粒精液在经液氮冷却的氟板（聚四氟乙烯）、铜纱网、铝板上滴冻。要使承 接精液的表面与液氮面保持一定的距离（1～2厘米）。在滴冻的过程中，要维持一 80～一120℃的温度。滴冻前要将经平衡的精液充分混匀。并检查精子的活率。 滴要迅速，颗粒要均匀，每毫升经过稀释的精液滴10粒左右为宜。滴冻结束后，要 停留2～3分钟，待所有颗粒已冻结立即投入液氮。经抽样检查（一般随机抽取2粒） ，解冻活率在0．3以上者，即可装于纱布袋中，经标记后在液氮中保存。每滴冻完 一头公牛的精液后，必须更换氟板等用具。 目前，细管的容量分0．25毫升和0．5毫升两种，由无毒塑料（聚氯乞烯）制 成。管的一端填有棉塞和聚乙烯粉未，粉未遇水即固化自动封口，输精时又成为推 送精液的活塞；另一端在注入精液后，可以聚乙烯粉或钢珠（或塑料珠）封口，要 注意在封口处与精液间留有10～13毫米的空间，防止冷冻过程中咽膨胀引起细管爆裂。

二、精液贮存和解冻

（一）精液的贮存 牛的冷冻精液是以液氮做冷源进行贮存的，需要时可随 时取出。为防止温度变化对精液品质的影响，取放动作要迅速，尽量减少在空气中 停留的时间。从贮存容器中提取冷冻精液时，精液不应超过液氮容器的颈基部，避 免因温度的回升造成精液解冻活率的下降。 牛的冷冻精液已有40多年的历史。试验证明，保存至今的冷冻精液仍具有授精 能力。但一般认为牛的冷冻精液随保存时间的延长，精子的活力和授精能力逐渐降 低。牛冷冻精液长期保存的确切时限，尚需继续研究和观察。

（二）解冻 冷冻精液的解冻过程会影响精子的活力，要注意解冻的温度和操作方法。 最初世界各国对解冻温度的要求不同，大体可分为高温40℃、室温15～20℃和 冷水10℃3种。当前认为40℃左右解冻效果最好。随着解冻温度的降低， 精子活率 有逐渐降低的趋势。 解冻方法：颗粒精液解冻多采用一定量的经预热至40℃的解冻液，将颗粒精液 投入其中，经摇动至融化。解冻液可用2．9％的柠檬酸钠溶液，也可用含葡萄糖3 ％和柠檬酸钠1．4％的溶液。制成的解冻液，分装于安瓿内，经灭菌和封口后可长 期使用。 细管精液的解冻应将封口端向上，棉塞端朝下，投入40℃左右的温水中，待细 管颜色一变立即取出用于输精。解冻后的精液应立即取样检查活率，凡在0．3以上 者即可使用。若一次输精母牛头数较多，也可在输精前随机抽样检查。 解冻后的精液其精子存活时间较短，几乎均采用距输精数分钟至１小时之内解 冻，才能保证较高的受胎率。 为了方便起见，国内外一些人工授精员在到现场输精前将细管冷冻精液装入贴 身的衣袋内、用体温使其解冻后进行输精，这是一种简便而有效的方法。