目前在全世界范围内，牛的人工授精已普遍采用冷冻精液输精。因此，在奶 牛人工授精中的精液品质检查，主要是指在输精前后，对解冻后的精液进行检查。 国内外公牛的冷冻精液都有严格的质量标准，用户对其质量的检查主要是进一步核 实其质量，了解或发现操作中的问题。
一、 精子解冻活率检查
（一）颗粒冷冻精液 取消毒并封装于安瓿内的稀释液（一般为2．9％柠檬酸 钠1毫升），放于40℃的温水中，待其温度接近40℃时，打开安瓿放入颗粒冷冻精液1粒，轻轻摇动，使其融化，即可取样在高倍显微镜下观察其活率。 检查时显微载物台的温度应保持在37℃左右。在评定活率时，要注意上、中、下三个层次精 子活率的变化，左、右、上、下四个方位视野的差异，才能做出较准确的判断。活 率在0．3以上即为合格精液。
（二）细管冷冻精液 可直接投入40℃温水中，待其融化后，立即取出，剪去棉塞一端，取样检查。
二、 死活精子比例检查 先将精子死活染色液分装于容量为0．5毫升左右的指形玻璃小管中，染色液 为伊红。苯胺黑溶液（含5％水溶性伊红和1％苯胺黑溶液），染色前先放入37℃恒 温箱或水浴箱中预热，滴入解冻精液2～3滴，混匀后再放入温箱，3 分钟后即可制做抹片，待抹片风干革命后在油镜下观察。死精子为红色，活精子不 着色或只在头部的核环处呈淡红色。随机观察200个精子并计算出死、活精子的比例。 用这种方法所得到的活精子百分数要高于精子的活率。对于活率观察，技术熟练、估计准确的人 员可不做精子死活染色的检查。
三、 密度检查 对精子密度检查的最简单方法是，取1滴解冻精液在低倍显微镜下凭经验粗略 地估计其密度是否符合输精的要求。 较精确的方法是采用血球计数装置，进行精确的计算，具体方法在这里不作 介绍。以此为基础建立起来的光电比色法测定精液中精子密度，已经被大型公牛站广泛应用。 通过密度的检查可以计算出被检精液每毫升所含的精子数，再根据解冻后的 活率可得每毫升精液中的有效精子数（即呈直线前进运动的精子数），最后乘以输精剂量（颗粒冷冻精液为0．1±0．01毫升；细管冷冻精液为0．5毫升或0．25毫升） 计算出每个输精剂量的有效精子数（颗粒冷冻精液为1200万以上；细管冷冻精液为 1000万以上）。
四、 其他方面的检查 包括畸形精子的比例、顶体完整率、生存指数等方面的检查。在一般生产条件下是不进行的，只有在输精后母牛的受胎率明显下降又很难找到确切的原因时，才送交有关实验室进行这些项目的检查。 第三节 奶牛精液的冷冻保存 到目前为止，在各种家畜中，牛的精液冷冻保存技术最为成功，已形成一套完整定型的工艺流程。
（一）、 冷冻稀释液的选择和配制
（1）稀释液的选择牛冷冻精液稀释液的种类较多， 可根据自身的经验和条 件选用并固定1～2个最适宜的稀释液配方。
（2）稀释液的配制原则 第一，配制稀释液所使用的一切用具，必须经认真清洗和严格消毒。 第二，稀释液要现用现配，保持新鲜，经密封、消毒的稀释液，允许在0～5℃ 的冰箱中保存1周。但卵黄、抗生素、酶、激素等有生物活性的物质， 必须在用前 临时添加。 第三，稀释用水应为蒸馏水或重蒸馏水，要求保持新鲜、中性。 第四，配制稀释液所用的化学制剂要纯净，一般要求化学纯或分析纯；称量 要准确无误，经充分溶解、过滤后进行消毒（隔水煮沸或蒸气消毒）。 第五、卵黄和奶类成分要求新鲜、无污染、无杂质。 第六，抗生素等有生物活性的物质，必须在稀释液冷却至室温时加入，以免 失去活性。 （二）、精液的稀释
（1）稀释倍数的确定对原精液的稀释倍数主要依据精液的精子密度和活率， 以及精子解冻后的活率来确定，虽无具体规定，但必须保证每个输精剂量中，在解 冻后所含的有效精子（直线前进运动的精子）数达到规定的标准。例如，60年代， 国外冷冻精液的稀释倍数只有一个大致的范围，英国不超过50倍，爱尔兰10倍左右， 法国9～23倍，前苏联10～25倍，美国为30～50倍，保证每个输精剂量有1500 万有 效精子。 我国当前在颗粒冷冻精液的生产中，由于颗粒体积的缩小和解冻后的再稀释， 一般按原精液做1：2～4倍稀释。滴冻颗粒为0．1毫升，解冻时每毫升的解冻液加 入一粒，即为一个输精剂量。其中含有效精子不少于1000万，仍可获得理想的受胎 效果。实际上，其最终稀释倍数是30倍左右。
(2）稀释方法 甘油是牛精液冷冻保存的重要保护剂，但它对精子同时也具有性。为减低甘油对精 子的有害作用，多采用两次稀释，即采精后先用不含甘油的 第一液稀释到最终稀释倍数的一半，经缓慢降温（不少于60分钟）至4～5℃的温度 下，再加入同温等量含甘油的第二液。第二液的加入方法有一次或多次加入，以及 缓慢滴入等方法。甘油的最终浓度通常为7％。 近年来，在试验的基础上，我国有的采用一次稀释的方法。即采精后用同温 的含甘油稀释液一次稀释完成，也取得了良好的冷冻保存效果。
（三）、精液的低温平衡 平衡是指精液加入含甘油的稀释液后，需在4～5℃的条件下放置的时间。在 此之前，首先要把采精后稀释的精液缓慢降温至4～5℃。具体做法是：将装精液的 容器外面包以纱布、棉花，或放入同温的水中，再放入0～5℃的冰箱中，经1 小时即可达到降温的目的。 牛精液在冷冻前各国采用的平衡时间差异较大，我国一般在2～4小时。
（四）、精液分装和冻结
（1）分装牛精液在冷冻前可采用玻璃安瓿、塑料细管和颗粒3种分装方法。 目前应用较多的是后面两种，并且细管法日渐增多。颗粒法虽有容积小、操作简单、 成本低、快速冻结效果好等优点，但存在着不易标记、易破损和污染以及解冻再稀 释等问题。 细管法具有卫生条件好、容积小、可快速冷冻、精子损耗少，、易标记和适 于机械化生产等优点。到目前为止，我国仍多采用颗粒法冷冻，但已逐步向细管法 过渡。 精液分装前，塑料细管要用打印机作好有关标记（公牛号、品种、生产日期 等），并在紫外线灯下照射消毒。 分装是用专门的机械进行的，分装后即可放入0～5℃的。冰箱缓慢降温和平 衡，时间与颗粒法相似。 冻结时，将平衡后的细管平放在纱网上，放置在距离液氮面2～3厘米处，停 留7～8分钟，随后浸入液氮。经抽样检查合格后，即可按一定包装规格包装并在液 氮中长期保存。
（2）冻结 牛精液冷冻的冷源普遍应用液氮。颗粒精液在经液氮冷却的氟板（聚四氟乙烯）、铜纱网、铝板上滴冻。要使承 接精液的表面与液氮面保持一定的距离（1～2厘米）。在滴冻的过程中，要维持一 80～一120℃的温度。滴冻前要将经平衡的精液充分混匀。并检查精子的活率。 滴要迅速，颗粒要均匀，每毫升经过稀释的精液滴10粒左右为宜。滴冻结束后，要 停留2～3分钟，待所有颗粒已冻结立即投入液氮。经抽样检查（一般随机抽取2粒） ，解冻活率在0．3以上者，即可装于纱布袋中，经标记后在液氮中保存。每滴冻完 一头公牛的精液后，必须更换氟板等用具。 目前，细管的容量分0．25毫升和0．5毫升两种，由无毒塑料（聚氯乞烯）制 成。管的一端填有棉塞和聚乙烯粉未，粉未遇水即固化自动封口，输精时又成为推 送精液的活塞；另一端在注入精液后，可以聚乙烯粉或钢珠（或塑料珠）封口，要 注意在封口处与精液间留有10～13毫米的空间，防止冷冻过程中咽膨胀引起细管爆裂。
二、精液贮存和解冻
（一）精液的贮存 牛的冷冻精液是以液氮做冷源进行贮存的，需要时可随 时取出。为防止温度变化对精液品质的影响，取放动作要迅速，尽量减少在空气中 停留的时间。从贮存容器中提取冷冻精液时，精液不应超过液氮容器的颈基部，避 免因温度的回升造成精液解冻活率的下降。 牛的冷冻精液已有40多年的历史。试验证明，保存至今的冷冻精液仍具有授精 能力。但一般认为牛的冷冻精液随保存时间的延长，精子的活力和授精能力逐渐降 低。牛冷冻精液长期保存的确切时限，尚需继续研究和观察。
（二）解冻 冷冻精液的解冻过程会影响精子的活力，要注意解冻的温度和操作方法。 最初世界各国对解冻温度的要求不同，大体可分为高温40℃、室温15～20℃和 冷水10℃3种。当前认为40℃左右解冻效果最好。随着解冻温度的降低， 精子活率 有逐渐降低的趋势。 解冻方法：颗粒精液解冻多采用一定量的经预热至40℃的解冻液，将颗粒精液 投入其中，经摇动至融化。解冻液可用2．9％的柠檬酸钠溶液，也可用含葡萄糖3 ％和柠檬酸钠1．4％的溶液。制成的解冻液，分装于安瓿内，经灭菌和封口后可长 期使用。 细管精液的解冻应将封口端向上，棉塞端朝下，投入40℃左右的温水中，待细 管颜色一变立即取出用于输精。解冻后的精液应立即取样检查活率，凡在0．3以上 者即可使用。若一次输精母牛头数较多，也可在输精前随机抽样检查。 解冻后的精液其精子存活时间较短，几乎均采用距输精数分钟至１小时之内解 冻，才能保证较高的受胎率。 为了方便起见，国内外一些人工授精员在到现场输精前将细管冷冻精液装入贴 身的衣袋内、用体温使其解冻后进行输精，这是一种简便而有效的方法。
三.奶牛的输精。
一、输精时间的确定 奶牛的发情周期平均为21天左右，发情持续期较短，大约２0小时，排卵一 般发生在发情结束后10～16小时，因此，准确的发情鉴定，适时输精是提高受胎率 的有力保证。 奶牛输精的实践表明：在母牛接受爬跨（即站立发情阶段的末期或浚情后期 的开始阶段）；卵泡发育期的后期或卵泡成熟期输精坷获得最佳的受胎效果。 从母牛接受爬跨开始到排卵后的这段时间输精的不返情率表明；在母牛接受 爬跨第八至二十四小时输精的受胎率最高。 输精人员应掌握以下规律：母牛在早晨接受爬跨，应在当日下午输精，若次 日早晨仍接受爬跨应再输精1次；母牛下午或傍晚接受爬跨，可推迟到次日早晨输精。 如果输精员由本场人员担任，一般在第一次输精后12小时做第二次输精。如 果是个体饲养的小群奶牛，输精时间应更灵活些。
二、输精部位和输精次数
（一）输精部位 大量的试验证明，采用子宫颈深部、子宫体、排卵侧或排 卵侧子宫角输精的受胎率没有显著差异。当前普遍采用子宫颈深部（子宫颈内口） 输精。
（二）输精次数 冷冻精液输精，除母牛本身的原因外，母牛的受胎率主要 受精液质量和发情鉴定准确性的影响。若精液质量优良，发情鉴定准确，1 次输精可获得满意的受胎率。由于发情排卵的时间个体差异较大，一般掌握在1～2次为 宜。盲目地增加输精次数，不但不能提高受胎率，有时还可能造成某些感染，发生 子宫或生殖道疾病。
三、输精方法 输精方法有开张器输精和直肠把握输精两种。
（一）开张器输精法 借助开张器将母牛的阴道扩大，借助一定的光源（手筒、额镜、额灯等）找到子宫颈 外口，把输精管插入子宫颈1～2厘米处，注入精 液，随后取出输精管和开张器。此法虽然简单、容易掌握，但输精部位浅，易感染， 受胎率低。因此，目前很少采用。 （二）直肠把握子宫颈输精法与直肠检查相似，一只手戴上薄膜手套，伸入 直肠，掏出宿粪，寻找子宫颈，并握住子宫颈的外口端，使子宫颈外口与小指形成 的环口持平（图3一4）。用伸入直肠的手臂压开阴门裂，另一只手持输精器插入阴 门（插入时先斜上再转成水平，切勿将输精器插入尿道开口）。借助握子宫颈外口 处的手与持输精器的手协同配合，使输精器缓缓越过于宫颈内侧的皱褶（一般为42 个），然后注入精液，在把握子宫颈时，位置要适当，才有利于两手的配合，既不可靠前，也不可太靠后，否则难以将输精器插入子宫颈深部。 直肠把握子宫颈法是国内外普遍采用的输精方法，具有用具简单， 不易感染，输精部位深和受胎率高的优点。其受胎率比开张器法高出10%—20%，大幅度提高了 奶牛的繁殖率和经济效益。同时借助直肠触摸母牛子宫和卵巢的变化，也可进一步 判断发情或妊娠情况，防止误配或造成流产。 个人的授精技术对受胎率有很大影响，有经验的人工授精员可获得最佳的受胎 效果。在炎热的气候条件下，母牛的发情时间较短，全天进行输精都有效。在这种 条件下，奶牛饲养者自己进行人工授精操作往往可获得较好的结果，而受过一定人 工授精技术训练是获得最佳效果的保证。经常对人工授精人员进行考核有助于评价 和改进他们的输精质量和受胎效果。为了获得良好的受胎效果，精液应贮存于可定期检查的容器内。
四、产犊到第一次输精最佳间隔的确定 虽然产犊后首次输精时间提早可使母牛妊娠的时间提前， 但产犊后过早配种也 并非明智之举，因为：①产后泌乳早期需要一段时间恢复身体；②一产青年母牛在 下次妊娠前尚未完成自身的发育；③产后早期妊娠率很低；④实践证明奶牛的 产犊间隔少于365天并非有利；⑤更重要原因是产后过早配种其泌乳期达不到305天。 因此，许多生产者对一些高产牛都把产后第一次配种时间控制在产后85～95天。 五、母牛的再配种 很难做到所有的输精都能成功地妊娠，有时经多次输精仍不妊娠；有些虽然能 正常妊娠，但有时会在妊娠后发生胚胎死亡和流产。通常把在妊娠初期她天内的妊 娠失败称胚胎死亡；妊娠43～151天的妊娠中断称胎儿死亡；而把在此以后发生的 妊娠中断叫流产。胚胎死亡可能无任何明显外部症状，因此，母牛输精后继续进行 发情观察是十分重要的。特别是对输精3周后无发情表现而被认为妊娠的母牛更应 注意。对输精3～6周的母牛也应继续观察，发现返情，应及时再输精，以避免时间 和经济的浪费。最后一次输精经6～8周若无任何发情表现，应该进行妊娠诊断。如 果经多次输精仍不妊娠，就应及时淘汰。若牛群中有多头母牛出现类似问题，应及时检查和处理。实践证明，上述问题常常是管理不善所致。
