2.4 利用基因工程技术，创造新的抗CMV种质资源

    目前植物抗病毒基因工程主要包括3个领域，第1个领域是利用病毒本身的基因导入受体植物，获得抗性植株，所获得的抗性也称病原起源的抗性（pathogen-derived resistance）。这一领域的研究较多，已育成了不少抗性品种；第2、3个领域是分别利用植物中自然存在的抗性基因和植物、微生物的核糖体失活蛋白（RIPs）基因，获得抗病毒植物。第1个领域又包括利用病毒外壳蛋白（coat rotein，CP）基因、病毒复制酶（replicase）基因、病毒运动蛋白（movement pro tein，MP）基因、病毒反义RNA（antisense RNA）、核酶（ribozyme）基因、病毒卫星RNA（satellite RNA）等方法介导病毒抗性。目前在抗CMV转基因中利用较多的是CMV CP基因、CMV复制酶基因、CMV卫星RNA、CMV MP基因介导抗性。

    ①CMV CP基因介导病毒抗性研究 导入CMV CP基因是目前介导CMV抗性较为成功的一种方法。外壳蛋白是形成病毒颗粒的结构蛋白，其功能是包裹病毒的核酸（DNA或RNA），保护病毒核酸。20世纪50年代研究发现植物病毒具有交叉保护现象；20世纪70年代研究发现病毒外壳蛋白注入寄主体内具有抑制病毒侵染作用。人们从中得到启示：病毒外壳蛋白可能在病毒侵染中起重要作用。1986年Beachy研究小组首先将烟草花叶病毒（TMV）的外壳蛋白基因导入烟草，培育出了抗TMV的烟草植株。目前国内外已有包括CMV在内的30多种病毒的外壳蛋白基因被导入多种植物中，并获得了对病毒的抗性。我国科研工作者成功地将CMV CP基因导入番茄、西番莲、甜椒、黄瓜等蔬菜作物，转化的植株对CMV侵染表现出不同程度的抗性。

    外壳蛋白介导抗性的作用机理可能有以下两种情况：a.外壳蛋白包被理论。这是目前较为流行的理论。一种病毒感染植株后会复制产生大量外壳蛋白，使再次侵入的另一种病毒无法进行脱壳或脱壳后核酸被另一种外壳蛋白包被，从而干扰第二种病毒的复制；b.病毒外壳基因的RNA参与干扰病毒的复制。

    通过导入病毒CP基因获得的抗病植株，抗性常表现以下特点：a.抗性能力与CP蛋白的表达量呈正相关；b.抗性与接种的病毒浓度有关，高浓度病毒接种能克服CP介导的抗性；c.抗性只对病毒粒子起作用，一般不抗裸露的病毒RNA的攻击。

    ②CMV复制酶基因介导病毒抗性研究　植物抗病基因工程另一个重大进展是利用病毒RNA复制酶基因的一部分转化植物。非完整或非正常复制酶基因表达产物干扰了正常病毒的复制过程，导致病毒复制受到抑制和病毒基因非正常表达，使其无法继续侵染和繁殖，这些是复制酶基因介导抗病性的主要原因。Anderson等将CMV Fny株系的RNA2内部缺失94个核苷酸后利用农杆菌介导转入烟草，获得的转基因植 株对CMV表现高度的抗病性。谢响明用缺失的复制酶基因通过农杆菌介导转化烟草和番茄品种，转基因烟草、番茄对CMV表现较高的抗病性。利用病毒复制酶基因介导的抗性具有以下特点：a.对完整的病毒粒子和裸露的病毒RNA都具有高度的抗性；b.高浓度接种条件下抗性不变；c.抗病水平与基因整合的拷贝数无关；d.抗性持续时间长，而且对高温不敏感；e.抗性具有较好的稳定性和株系专化性。因而利用转复制酶基因组分有望获得高水平的抗CMV植株，其不足之处是抗性范围过于狭窄。

    ③卫星RNA介导病毒抗性研究 卫星RNA是独立于病毒基因组之外，依赖于其辅助复制的小分子RNA。一般认为由卫星RNA介导的抗病机制是卫星RNA与病毒RNA竞争复制酶，从而干扰病毒基因组的复制，使表达卫星RNA的转基因植株抗病性得到提高。美籍印尼学者Kaper等在1976年首次发现CMV卫星RNA。1986年，英国科学家Baulcombe把CMV的卫星RNA转成cDNA，再转入烟草，第一次得到了抗CMV的转基因植株，1989年我国学者吴世宣等也成功获得了CMV卫星RNA介导的抗CMV烟草。Harrison等（1987）将一个编码CMV卫星RNA的基因转到了烟草植株基因组中，获得抗CMV的转基因植株。卫星RNA介导抗性具有低水平卫星RNA表达可起到抗病毒作用，不致于对植物产生危险的优点，但是这种方法存在着一些缺陷：含有卫星RNA的病毒种类少，大大限制了此法的应用范围；卫星RNA有良性和恶性之分，恶性可加重病症，而且良性与恶性卫星RNA的DNA序列同源性较高，同时卫星RNA突变率高，良性易转化为恶性；另外，卫星RNA转化的植株只是作物生长晚期抗病。