仔猪轮状病毒性腹泻主要以腹泻、厌食、呕吐、脱水为特征,一旦暴发就可能连年发生,患病猪和隐性带毒猪是该病的主要传染源。Woode等在1974年首次从猪分离出轮状病毒。中国于1982年从腹泻猪粪便中分离到轮状病毒。澳大利亚、美国、英国等先后都有关于该病毒的报道,目前该病在全世界普遍存在。我国轮状病毒流行的特点是混合感染,由于饲养环境较差,人们往往认为这一时期仔猪腹泻是大肠埃希菌引发,其实轮状病毒是其发病的一个重要诱因。轮状病毒性腹泻对人类健康和畜牧业发展都有较大危害,在全球已成为一个重要的公共卫生问题。
1 病原学
1.1 病毒形态及分子特征
轮状病毒(Rotavirus,RV)属呼肠病毒科,轮状病毒属,分为A,B,C,D和E和F6个群,在发生腹泻的动物中最常见的是A群,感染猪的RV有A群、B群、C群和E群。其中,A群称为典型RV,其他则称为非典型RV。纯化的病毒在电镜下略呈球状,具有双层衣壳,直径为65nm~75nm,20面体对称。病毒的中央为一个电子致密的六角形核心,直径37nm~40nm,即芯髓;周围有一电子透明层,壳粒由此向外呈辐射状排列,构成内衣壳;外周为一层光滑薄膜构成的外衣壳,厚约20nm。RV因其形似车轮状结构而得名。病毒颗粒在感染的粪样和细胞培养物中以两种形式存在,一种是含有完整外壳的实心光滑型颗粒,大约70nm~75nm,具有传染性;另一种是不含外壳且仅含有内壳的粗糙型颗粒,大约50nm~60nm。
病毒体核心是由11个不连续的双股正链RNA片段组成,除了片段11具有2个开放阅读框外,其他的片段只有1个开放阅读框。每一片段各编码一种蛋白,包括6种结构蛋白即VP1~VP4,VP6和VP7。VP1~VP3为芯髓蛋白,VP4和VP7为外衣壳蛋白,VP6为内衣壳蛋白。在病毒侵入细胞的过程当中VP4起到关键作用,VP4经胰蛋白酶(Trypsin)裂解可产生VP5(60ku)和VP8(26ku)2个结构部分,与病毒附着、聚集有重要关系,并能提高病毒感染性。研究表明,VP7具有稳定VP4结构的作用。此外,还有5种非结构蛋白即NSP1~NSP5,其中NSP1,NSP2,NSP3,NSP5为RNA结合蛋白,与病毒的复制、合成和表达有关。NSP4是一种糖蛋白,与病毒粒子从内质网出芽有关,在病毒的复制以及致病机理方面具有重要作用。NSP4的突变可以影响病毒的毒力。
1.2 病毒分型
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术可将RV的11个双链RNA片段分离,所形成的11条电泳带可以分为4个区段,常见的人和动物的电泳带的排列位置为4∶2∶3∶2,统称为A群,又叫典型RV。此外,以第10和11节段在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率上的差异,A群RV又分长型和短型。其他统称为非典型RV,分别为B,C,D,E,F和G群。RV属于呼肠病毒科RV属的A,B,C和E群。RV粒子表面共有3种抗原,即群抗原VP6、中和抗原VP7及血凝素抗原VP4。根据群抗原VP6可以分为不同的亚群,大多数动物的A群RV为Ⅰ亚群;VP4和VP7在病原的检测和产生中和抗体以及免疫性保护过程中具有重要意义,可根据VP4和VP7分为不同的血清型系统。根据VP4形成的血清型为P(Proteasesensitive)型,VP7形成的血清型叫G(Glycoprotein)型。RV不同血清型之间的交叉反应性较差,根据RV的分子流行病学调查发现,目前已知至少有18种P血清亚型和14个G血清亚型存在。在世界广泛流行的A组RV主要有4种G和P血清型组合――G1P8,G2P4,G3P8和G4P8。
1.3 培养特性
RV于1968年由美国的MebusMS等首次从犊牛粪便中分离成功,1980年,美国的Waytt将人的Wa株首次利用非洲绿猴肾原代细胞培养成功。RV在体外不易培养,需要特殊培养条件,除A型RV外,其他RV的许多毒株迄今未能适应细胞培养,A型RV分离的成功率为40%~70%。因此,只能通过感染易感动物来分离和复制病毒,培养过程需加胰蛋白酶和胰凝乳酶等处理。黄旭雯等利用CV-1细胞增殖培养RV时发现,同时添加40mL/L的鸡血清和10μg/mL胰蛋白酶有利于RV的复制。此外,RV感染细胞具有特定的趋向性,在体内只感染肠绒毛上皮细胞,在体外尽管可以吸附许多细胞,但是只感染肾或肠道上皮细胞来源的细胞。培养RV常用的细胞系为MA-104、AGMK、CV-1、MARC-145等,但最适合用MA-104培养。
1.4 稳定性
RV对理化因素的作用有较强的抵抗力,粪便和乳汁中的病毒在18℃~20℃室温中经7个月仍有感染性,而蛋白水解酶如胰凝乳蛋白酶,能增强RV的感染性。耐乙醚、氯仿、去氧胆酸钠、次氯酸盐和脂溶剂,对酸稳定,pH3.5~10.0范围内病毒保持感染力。经反复冻融,超声波处理,以及37℃下1h仍不失活。但EDTA,EGTA等促溶剂及CaCl2、硫氯酸钾等可使双衣壳病毒粒子变为单衣壳病毒粒子,使芯髓部分的密度发生改变,病毒聚合酶的活性丧失而失去感染力。另外0.1g/L碘、10g/L次氯酸钠、700mL/L酒精、臭氧、酚等可灭活病毒。
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