２．２免疫学方法 在８一细胞期至早期胚泡期，哺乳动物的雄性胚胎表达一种雌性胚胎所没有的细胞表面因子，即Ｈ-Ｙ抗原，利用Ｈ-Ｙ抗原和抗体免疫反应的原理可以进行胚胎的性别鉴定。

２．２．ｌ胚胎的细胞毒性分析[5,6] 在补体（如豚鼠血清）存在的情况下，Ｈ－Ｙ抗体可以与ＨＹ+胚胎（雄性胚胎）结合，并使其中的一个或更多的卵裂球溶解，或使卵裂球呈现不规则的体积和形状，阻滞胚胎发育，受影响的胚胎即为雄性胚胎，将经培养后发育正常的雌性胚胎进行移植就可使母畜只生雌性后代。但这种方法是以破坏雄性胚胎为代价，而且其准确率不高，经这种方法鉴定的Ｈ-Ｙ+鼠胚胎移植后所生仔鼠只有８５％为雌性，这种方法很少被使用。

２.２.２间接免疫荧光分析法[5,6]以Ｈ-Ｙ抗体为一抗，用FTTC标记的Ｙ球蛋白（如山羊抗鼠Ｙ球蛋白）作为二抗，将上述两种抗体依次与胚胎共同培养，雄性胚胎上的Ｈ-Ｙ抗原先与一抗结合，一抗再与二抗结合，然后通过洗涤将未结合到胚胎上的二抗洗去，由于二抗用FTTC标记，故在荧光显微镜下显荧光，雄性胚胎显荧光，不显荧光者为雌性胚胎。这是一种非损害性胚胎性别鉴定法，鉴定过的胚胎都可以存活。但准确率不高，牛83％、绵羊为83％、猪为81％。

２．２.３ 囊胚形成抑制法利用Ｈ-Ｙ抗体能够可逆性抑制囊胚形成的原理，将Ｈ-Ｙ抗血清与桑葚胚共培养，一段时间后雄性胚胎由于具有Ｈ-Ｙ抗原被Ｈ-Ｙ抗体所抑制，不能形成囊胚，而无Ｈ-Ｙ抗原的雌性胚胎则不受影响继续发育成囊胚，因此可以将雌、雄胚胎分开。然后可洗去Ｈ－Ｙ抗体，雄性胚继续发育。这种方法鉴定的胚胎存活率与正常无异，其正确率为８０％左右。但只能检测桑套期前的胚胎，如果胚胎已发育至囊胚，则无法鉴定。

２．３ 测定卵裂球Ｘ_染色体连锁基因剂量鉴别胚胎性别[7]从胚胎中取出一个卵裂球，采用双重微量测定法，测定其与Ｘ_连锁的次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（ＨＰＲT）和与常染色体连锁的腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（ＡＰＲＴ）的活性。由于在８一细胞阶段，雌性胚胎中的两条Ｘ染色体均有活性，因此可根据ＨＰＲT活性在基因剂量上的两倍差异，得到ＨＰＲT与ＡＰＲT比率的双态分布图，因而鉴别出雄性和雌性胚胎，该方法比较繁琐，所需时间长。

３ 分子生物学方法

３．1 ｙ-染色体特异性ＤＮＡ探针利用Ｙ-染色体特异的ＤＮＡ探针与Ｙ-染色体的ＤＮＡ进行特异性结合，以鉴定胚胎性别的一种方法。早在１９８８年，ＥｉｌｉＳ等就将牛的Ｙ-染色体ＤＮＡ重复序列探针用于牛胚胎的性别鉴定。用于检测的方法有两种：一种是原位杂交；另一种是用探针与ＤＮＡ提取物相结合。这种方法的准确率超过９５％。但是这些特定序列通常具有种间特异性，所以对每种动物都必需研制不同的探针。另外，原位杂交有时还需使用放射性物质，这种方法没有被推广。

3.2聚合酶链式反应（ＰＣＲ）应用于胚胎性别鉴定ＨｅｒＴ等（1990）首先成功建立了家畜胚胎性别鉴定的ＰＣＲ法[8]。ＰＣＲ法因其特异性强、灵敏度高、快速、简便、经济等优点，在家畜早期胚胎的性别鉴定中占有越来越重要的位置，其实质就是Y-染色体特异性片段或Y-染色体上的性别决定基因的检测技术。即通过合成ＳＲＹ基因或其他Y-染色体上特异性片段的部分序列作为引物，在一定条件下进行ＰＣＲ扩增反应，能扩增出目标片段的胚胎即为雄性胚胎，否则即为雌性胚胎。由于ＰＣＲ极为灵敏，所以只要从胚胎中取出几个细胞就可以进行性别鉴定，这对性别鉴定后胚胎移植的妊娠率没有影响。龚荣慈，等实验表明，只要8ｐｇ的ＤＮＡ即可检出ＺＦＹ、ZFX序列而判定胚胎的雌雄[12]。在国内，曾溢滔，等（１９９１）就通过对牛ＳＲＹ基因的直接测序，设计引物用ＰＣＲ扩增ＳＲＹ基因来检测奶牛胚胎的性别[9]，杨建明，等[10]（１９９５）、欧阳红尘[11]（１９９５）等则通过扩增牛Ｙ染色体特异ＤＮＡ序列来鉴定牛早期胚胎性别，而龚荣慈，等设计了特异于牛ＺＦＹ基因的引物对奶牛基因组ＤＮＡ进行ＮestPCR来进行性别鉴定。黄淑帧，等通过扩增ＳＲＹ基因对转基因试管牛和试管羊胚胎进行了性别鉴定，得到的转基因牛和转基因羊的性别和鉴定结果完全一致[13]
用ＰＣＲ鉴定家畜胚胎的性别其主要程序为：①胚胎的获取：冷冻胚胎、刚从供体牛回收的鲜胚或体外受精培养的胚胎都可以用来鉴定性别；②引物的设计：根据Ｙ染色体上的性别决定基因或特异性片段设计引物，同时设计一对公母共有基因引物作为内对照，避免假阳性的发生；③用显微操作或徒手从胚胎中取出几个细胞热处理后进行ＰＣＲ扩增；④电泳检测。能同时扩增出Y-染色体上相应片段和公母共有基因片段的胚胎即为雄性胚胎，而只能扩增出共有基因片段的胚胎即为雌性胚胎。