二、冷冻精液及其应用

　　(一)冷冻精液的原理 常温或低温保存的精液，精于仍有代谢作用，所以保存的时间不会太长。现在已能将精液保存温度降到冰点以下，使精液冷冻起来，完全停止代谢作用，从而使精液保存几个月甚至长达几十年。冷冻精液保存时间长，远距离运输方便，对普及人工授精，扩大优秀公羊的利用率起着非常重要的作用。冷冻精液的冷冻源有两种：一种是干冰，即固体二氧化碳，其致冷温度为-78℃。一般用保温瓶或冰瓶作容器；另一种是液态氮气，其致冷温度达-196℃，因此必须要用液氮罐贮存。由于精液是在冰点以下的温度中保存，精子的细胞液和细胞质可能会因渗透压不同而冰点下降度不同。细胞液和细胞质在通过冰点时不能同时冻结造成精子细胞成分分离，从而打击精子活力，形成不可逆的冷休克。冷冻精液的冷打击温度为0～-40℃,。为了减少打击温度对精子的伤害，冷冻精液的稀释液应含有甘油保护成分，其稀释倍数、稀释次数及稀释方法均与常温或低温保存相同。 科学家们研究发现，稀释液中如果含有甘油，就可避免精子发生冷休克，顺利地通过滴冻过程中的冷打击温度。一般甘油含量为稀释液容量的7％～10％。冷冻精液稀释多采用“卵黄～柠檬酸盐一甘油”，或“卵黄～糖一甘油”稀释液。为减少甘油对精子的有害作用，先以不含甘油的稀释液将精液稀释至最后倍数的一半，经1～2小时缓慢降温至5℃，再用含甘油的稀释液进行第二次稀释。精液经过两次稀释后，含甘油的稀释液对精液起作用需要一定时间，使甘油渗透到精子体内，达到渗透活性物质平衡，使精子具有抗冻能力。处理方法是把精液放进5℃冰箱内平衡2～5小时。

　　(二)冷冻精液的方法 根据不同冷源和分装方式，冻结方法有下列两类： 1．干冰埋藏法 颗粒滴冻：是用干冰为冷源制作颗粒冻精的方法。在盛满干冰的容器中，用模板在干冰表面上压孔，孔径为0.5厘米，深2～3厘米。用滴管把平衡好的精液按0．1或0．2毫升的量滴入干冰孔窝内，再用干冰封埋2～4分钟后移液氮或干冰内贮存。 2．液氮熏蒸法 (1)颗粒滴冻 在装液氮的容器上放一铜纱网，距液氮面1～3厘米预冷几分钟，把经平衡处理的精液按定量均匀地滴在纱网上过2～4分钟，待冻精颗粒变白时再收集到贮精瓶内，移入液氯罐中保存。滴冻过程中，可用消毒铝饭盒盖替代铜纱网。 (2)细管、安瓿分装　精液可采用颗粒滴冻的相同方法处理。

　　(三)解冻方法　细管、安瓿分装的冻精，可以直接在35～40℃的温水中解冻，只等细管或安瓿内的精液融化一半时，便可以从温水中取出来以备使用。解冻颗粒精液有干湿两种方法： 1．湿法解冻 是在灭菌试管内注入1毫升1．9％柠檬酸钠解冻液，将试管在水浴中加热至35～40℃，取出颗粒精液 投进试管内，摇动融化以备使用。 2．干法解冻 是直接将颗粒冻精置于灭菌试管内，然后在水浴中加热至35～40℃解冻即可。冷冻精液解冻后立即进行镜检，活力达到0．3以上的就可以用于输精。要提高冻精的受胎率，一般采用1：1的低倍稀释，40℃干法快速解冻，1亿左右有效精子数的大量输精和一个情期二次重复输精等方法。

　　三，超数排卵与胚胎移植

　　(一)超数排卵 促卵泡素(FSH)能促使卵泡发育，促黄体素(LH)能引起排卵，使用有这些功能的促性腺激素类似物处理繁殖母羊，使其在未经处理时每个情期中只排1～7个卵的基础上增加排卵数量，这就是超数排卵技术，简称“超排”。超数排卵处理可使母羊在一个情期内排出20个卵，个别母羊可高达50个卵。促使母羊超排的最佳时间是在发情周期的第12～13天，在羊颈静脉注射促卵泡素(FSH)200～300国际单位，静脉注射促黄体素(LH)100～150国际单位，可获得超排效果。还可以使用促卵泡素(FSH)的类似替代物孕马血清(PMSG)和 促黄体素(LH)的类似替代物绒毛膜促性腺激素(HCG)，同样在母羊发情周期的第12～13天，根据体重大小皮下注射孕马 血清(PMSG)600～1100国际单位，出现发情表现后再注射绒 毛膜促性腺激素(HCG)500～700国际单位。如果没有孕马血清的制成品，可采妊娠50～90天期间的孕马全血注射，一般每毫升孕马全血含有50～200国际单位，由此可以推算全血用量。超数排卵的目的在于输精后能获得较多的受精卵，将其移植即可“借腹怀胎”形成新的个体，因此超数排卵只是胚胎移植的环节之一。