B42染色方法

　　421涂片：在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，用接种环挑取斜面上少许菌苔，在载玻片的水滴中轻蘸几下。将玻片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥B422涂片干燥后，滴加甲液染3!5min，用蒸馏水冲洗。加乙液染30!60s，并在酒精灯上加热，使其稍冒蒸气而染液不干，然后用蒸馏水冲洗，干后镜检。

　　B43染色结果

　　菌体为深褐色，鞭毛为褐色。

　　附录C

　　（标准的附录）

　　菌种固氮效能测定方法

　　在500mL三角瓶中加入100mL无氮培养基（含糖1%即1g），121灭菌30min。无菌操作，每瓶接入两环待测菌种（或1mL培养3d的培养液），放置摇床上振荡（120r/min）

　　30培养5!7d后，取出定糖测氮。

　　定糖采用蒽酮光电比色法。

　　测氮采用半微量光电比色法。

　　C1蒽酮光电比色法

　　C11测定原理

　　糖类遇硫酸即脱水成为醛类，再变成呋喃衍生物，后者与蒽酮缩合，生成蓝绿色化合物。于580!650nm处进行比色测定（蒽酮可与单糖、双糖、淀粉、糊精等反应），该方法适

　　合于含糖量0003%以上的样品。

　　C12试剂和仪器

　　分析中除有说明外，限用分析纯试剂和GB/T6682中规定的三级水。

　　C121硫酸。

　　C12202%（m/V）蒽酮溶液：称取02g蒽酮于100mL硫酸中。充分搅拌，使其溶解。

　　该溶液不稳定，应当天配用。

　　C123葡萄糖标准液：准确称取葡萄糖1000g，溶于水中，定容至1000mL，即为

　　1000mg/mL标准液。

　　C124分光光度计。

　　C13分析步骤

　　C131试样处理

　　取发酵培养的菌液100!400mL（取决于含糖量），稀释至10000ml，取此稀释液100mL于比色管中，加水至200mL，每管加入蒽酮试剂400mL，摇匀，水浴加热15min，使之充分显色，冷却后，于580!650nm处进行比色测定，记录吸光度，同时进行空白试验。

　　C132标准曲线绘制

　　吸取葡萄糖标准溶液100、200、400、600、800、1000、2000mL。于100mL容量瓶

　　中，加水至刻度，该液分别含糖10、20、40、60、80、100、200%g/mL。

　　吸取1.00mL放入比色管中，加水至2.00mL，按C1.3.1方法测定，记录吸光度用标准系列的含糖量定义横坐标，吸光度为纵坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

　　C14分析结果的计算

　　100mL溶液的含糖量（X）按式（C1）计算：

　　X=（m1-m2）100

　　m10010-6…………………………（1）

　　式中：m1———标准曲线上查出的试验含糖量，%g/mL；

　　m2———标准曲线上查出的空白试验的含糖量，%g/mL；

　　m———吸取发酵溶液体积，mL。

　　C15允许差

　　a）取平行测定的算术平均值为测定结果；

　　b）平行测定结果的允许差不大于0005g/100mL。

　　C2固氮菌液全氮比色测定法

　　C21测定原理

　　在硫酸铜或硫酸钾存在下，浓硫酸中加入菌液，并加热使试样全部有机氮转化为氨态氮，与奈氏试剂反应，于波长420nm处进行比色测定。

　　C22试剂和仪器

　　分析中除非另有说明，限用分析纯试剂和GB/T6682中规定的三级水。

　　C221硫酸（GB/T625）。

　　C222双氧水

　　C223氢氧化钠（GB/T629）2mol/L溶液：称量8g氢氧化钠溶于水中，定容至100mL。

　　C22440%（m/V）氢氧化钠（GB/T629）溶液：称取40g氢氧化钠溶于100mL。水中。

　　C22550%（m/V）酒石酸钾钠溶液：50g酒石酸钾钠溶于100mL水中。

　　C226奈氏试剂：71g碘化钾，10g碘化汞（HgI2）溶于少量水中，另配16g氢氧化钠溶于

　　70mL水中，冷却后将前一溶液缓缓倒入氢氧化钠溶液中，边加边搅拌，最后用水稀释至100mL，静置过夜，取清液储于棕色瓶中。

　　C227催化剂：1000g硫酸钾与100g硫酸铜共同研磨均匀，储于广口瓶中。

　　C228分光光度计。

　　C23分析步骤

　　C231试样制备和测试

　　吸取固氮菌液100mL于30mL消化管中，加硫酸（C221）3mL，加01g催化剂（C227）和5滴双氧水（C222）消煮至清亮，若反应液久煮不清，可冷却后加1!2滴双氧水（C222），继续煮至无色透明，取下冷却。加少许蒸馏水，摇匀，滴加40%氢氧化钠至出现氢氧化铜沉淀（约11!12mL），加酒石酸钾钠（C225）20滴，以去除氢氧化物沉淀掩蔽钙镁，将试管液全部转移至100mL容量瓶中，消化管洗涤液一并倒入容量瓶，稀释至刻度，摇匀。过滤，滤液1000mL于比色管中，加氢氧化钠（C223）100mL，加酒石酸钾钠100mL，加奈氏试剂3mL，摇匀，显色2!3min后，即倒入比色杯中，于420nm处比色计测定。读取吸光度。