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标准类别：NY-行业标准（农业）
关键词：固氮菌肥料
标准号：NY411—2000
标准名称：固氮菌肥料*
标准分类：农业土壤化肥标准
颁布部门：
颁布日期：
实施日期：
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1范围
本标准规定了固氮菌肥料产品的分类、技术要求、检验方法、检验规则、包装、标识、运输、贮存等。
本标准适用于含有益的固氮菌、能在土壤和多种作物根际中固定空气中的氮气，供作物氮素营养，又能分泌激素刺激作物生长的活体制品。本标准也适用于以固氮菌为主的含有能促进固氮、生长的植物促生根际细菌（PGPR）的复合固氮菌肥料。
2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
GB/T625—1989化学试剂硫酸
GB/T629—1997化学试剂氢氧化钠
GB/T1250—1989极限数值的表示方法和判定方法
GB/T6543—1986瓦楞纸箱
GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法
3定义
本标准采用下列定义。
31自生固氮菌
在土壤里能固定空气中的氮，供作物氮素营养，又能分泌激素刺激作物生长的微生物。
32根际联合固氮菌
既依赖根际环境生长，又在根际中固定空气中的氮气，对作物的生长发育产生积极作用的微生物。
33固氮效能
固氮菌每消耗1g碳水化合物（糖）从空气中摄取氮素的毫克数，固氮效能用mg氮/g糖表示。
4产品分类
41按剂型不同分为液体固氮菌肥料、固体固氮菌肥料和冻干固氮菌肥料。
42按菌种及特性分为自生固氮菌肥料、根际联合固氮菌肥料、复合固氮菌肥料。
5技术要求
51菌种
在含一种有机碳源的无氮培养基中能固定分子氮，并具有一定的固氮效能。菌体一般为短杆状（固氮螺菌属菌体呈螺旋状），革兰氏染色阴性。
511自生固氮菌
用固氮菌属（Azotobacter）、氮单胞菌属（Azomonas）的菌种，也可用茎瘤根瘤菌（Azorhizobiumcaulinodans）和固氮芽胞杆菌（Paenibacillusazotofixans）菌株。
512根际联合固氮菌
可用下列菌种固氮螺旋菌（Azospirillum）；阴沟肠杆菌（Enterobactercloacae）经鉴定为非致病菌的菌株；粪产碱菌（Alcaligenesfaecalis）经鉴定为非致病菌的菌株；肺炎克氏杆菌（Klebsiellapneumoniae）经鉴定为非致病菌的菌株。
使用本准则规定之外的菌种生产固氮菌肥料时，菌种必须经过鉴定，并符合51要求。
生产固氮微生物肥料所使用的菌种，必要时还要进行菌种染色鉴别（见附录B）和菌种固氮效能测定（见附录C）。
52成品技术指标（见表1）
表1成品技术指标
指标剂型
液体固体冻干
项目
乳白或淡褐色液体，黑褐色或褐色粉状，
外观、气味混浊，稍有沉淀，无湿润、松散，无异臭乳白色结晶，无味
异臭味味
水分，%—250!35030
pH值55!7060!7560!75
细度，过孔径018mm标准筛5200
的筛余物，%#
有效活菌数，个/mL（个/g、个/501081010850108
瓶）$
杂菌率1），%$5015020
有效期，2），月#3612
1）其中包括10-6马丁培养基平板上无霉菌。
2）此项仅在监督部门或仲裁检验双方认为有必要时才检测。
6抽样
按每一发酵罐菌液制成的产品为一批，逐批抽样检验。抽样过程要严格避免杂菌污染。
61抽样工具及用品
抽样前预先准备好无菌塑料袋（或塑料瓶）、金属勺、剪刀、封口机、牛皮纸封样袋、标签、抽样封条和胶水。
62抽样数量及抽样方法
在成品库抽样，可按“”形分层设点抽取，抽样以件为单位，小包装产品以一包装箱为一件。大包装（30!50kg）产品以一袋（或一桶）为一件。抽样件数由样品基数的大小确定。1!10件，全部抽样；11!200件，抽样10件；201!400件，抽取20件；样品基数大于
400件者，按超过部分的2%增加抽样件数，但总件数不要超过40件。
每件包装产品抽取一小袋，在无菌条件下每袋取样200g。然后将所有样品混匀，按四分法缩到2000g，分装4袋，然后封口。每2袋为一份装入牛皮纸封样袋。
液体产品每件吸取10mL，一同放入无菌的三角瓶中，混匀后分成两份，每份250mL。冻干产品，每件取一支放入无菌的三角瓶中，加无菌液体培养液，溶解混匀后分成两份，每
份50mL。贴上标签和封条（一份被抽样单位留存，一份交检测中心检测）。
7检验方法
71仪器设备及试剂
711仪器设备
生物显微镜（10100）；
菌落计数器；
恒温培养箱；
恒温干燥箱，
恒温摇床；
灭菌锅；
无菌室或超净工作台；
酸度计；
试管%15mm150mm，%18mm180mm；
培养皿直径9cm；
三角瓶500mL；
无菌吸管05、1、5、10mL；
玻璃刮刀；
滤纸；
酒精灯；
标准筛孔径018mm和015mm；
1号羊毛画笔；
无菌水；
无离子水。
712试剂
选择培养基（见附录A）；
刚果红染液（05%）。
72成品检验
721气味检验
取固氮菌肥料样品打开包装，进行感观检验。
722外观检验
将固体固氮菌肥料包装打开，装在白色搪瓷盘中，将液体固氮菌肥料摇匀，在明亮光线下进行感观检验。
723pH值测定
液体固氮菌肥料的pH值测定：取供检菌液直接测定pH值，取三次测定结果的平均数。固体固氮菌肥料的pH值测定：取50mL烧杯一个，加入菌肥25g，无离子水25mL。通过磁力搅拌器使溶液均匀后用酸度计测定pH值。取三次测定结果的平均数。
724含水量测定
称取固体固氮菌肥三份，每份2000g，精确到001g，放入已称恒重的铝盒中。置105干燥箱内烘烤4h，移至干燥器内，冷却后称重。根据烘干前后质量差按式（1）计算含水量。取三个样品测定数的平均值。平行样品绝对偏差应低于1%。
含水量（m
%）=0-m1
m100…………………………（1）
0
式中m0———烘干前样品质量，g；
m1———烘干后样品质量，g。
725吸附剂颗粒细度测定
称样1000g
（精确至001g），置于标准筛中（直径分别为018mm或015mm），用水冲洗，用毛笔轻刷，至粉末不再通过为止。将筛余物置105!110温度下烘干，称重。筛余物百分含量按式（2）计算：
筛余物（%）=筛余物量（1-样品含水量百分数）
样品质量100…………（2）
726有效活菌数和杂菌含量测定
采用平板计数法测定有效活菌数及杂菌率。
7261测定步骤
采样应不少于500g，从中称取1000g，加入带玻璃珠的100mL的无菌水中（液体菌剂取10mL，加入90mL的无菌水中），静置20min后在旋转式摇床上200r/min充分振荡
30min，即成母液的菌悬液。
用无菌吸管吸取5mL上述母液的菌悬液加入45mL无菌水中，混匀成110稀释的菌悬液，这样依次稀释，分别得到11102，11103，11104，11105等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。
用05mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液01mL，加至直径为9cm平皿的选择培养基（见附录A）表面，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面，或取1mL不同稀释度菌悬液加入培养皿内，与琼脂培养基混匀，每个样品取3个连续适宜稀释度，每一稀释度重复3次，同时加无菌水的空白对照。28培养2!3d后每个稀释度取5!10个菌落的菌体，涂片染色（见附录B）。显微镜观察识别后，选一个适宜稀释度（菌落在30!300个之间的平板），计算出同一稀释度三个平皿上菌落平均数。
杂菌数是指在选择培养基上，除有效活菌外的其他菌的菌落数与马丁培养基上霉菌数之和。马丁培养基10-4稀释度菌悬液加样，操作步骤同样品有效活菌数检测操作。
7262允许差
平行样品误差按式（3）计算，并应符合表2的规定。
*=%（x--x）
(n-1…………………………………（3）
式中*———单一标准差；
x———同一个稀释度任一个平板测定值；
-x———同一个稀释度平板测定的平均值；
n———重复次数。
表2平板上菌落数对应的单—标准差
平板上菌落数，个/皿30!5051!99100!300
单一标准差，100200500
7263测定结果的计算
按式（4）、式（5）计算样品的有效活菌数及杂菌率
有效活菌数（个/g）=菌落平均数稀释倍数母液菌悬液的体积（mL）
菌剂克数或毫升数
1
加样量（mL）……………………………………………………………………………（4）
杂菌率（%）=杂菌数
有效菌数+杂菌数100……………………（5）
727有效期检验在产品说明书标明的有效期到达前10d测定扰品各项指标，方法同721!726。
8检验规则
81检验分类
811产品出厂检验
产品交货时进行的检验。
812产品型式检验
新产品鉴定或国家质检机构质量监督检验。
82检验项目
型式检验的检验项目按52要求进行。出厂检验不检有效期。
83判定规则
831合格产品：
a）检验结果符合52所规定的技术指标的产品为合格产品；
b）产品有效活菌数符合指标，杂菌率不符合指标，但小于本标准规定的两倍时（液体10%、固体30%、冻干瓶4%），而且在马丁培养基平板上霉菌数小于30105，其他指标有一项不符合，也可判为合格产品；
C产品有效活菌数及杂菌率符合指标，在水分、外观、pH值、细度等次要检测项目中，有3项不符合技术指标，也判为合格产品。
832不合格产品
a）产品有效活菌数不符合技术指标或投入菌种没有完全相应的检验出，判为不合格产品；
b）产品杂菌率超过本标准规定的两倍（液体10%、固体30%、冻干瓶4%），判为不合格产品；
c）产品有效活菌数符合指标，杂菌率不符合指标，但小于本标准规定的两倍时C液体10%、固体30%、冻干瓶4%），其他指标有两项不符合指标，判为不合格产品；
d）产品检验在马丁培养基平板上霉菌数#30105，判为不合格产品；
e）产品水分、pH值、细度、外观等次要检测项目中，有4项不符合技术指标，判为不合格产品。
833含有植物促生根际细菌（PGPR）的固氮菌肥料产品检测时，只测固氮菌数量，不测
植物促生根际细菌的数量，也不视其为杂菌。
834本标准中质量指标合格判断，采用GB/T1250中修约值比较。
9包装、标识、运输和贮存
91包装
911内包装
液体肥料小包装用塑料瓶或玻璃瓶，大包装用塑料桶。固体肥料用不透明聚乙烯塑料袋包装。冻干菌剂用玻璃指形管真空干燥。
912外包装
外包装采用纸箱，纸箱质量应符合GB/T6543的要求。箱外用尼龙打包带加固。
913每箱（袋）产品中附有产品合格证和使用说明书，在使用说明中标明使用方法、用
量及注意事项。
92标识
在包装箱（袋）上印有产品名称、商标、标准编号、肥料登记证号、生产单位、厂址、生产
日期、批号和净重，并印有防晒、防潮、防冻等标记，若有必要还要加印易碎、防倒置等标
记。内包装上有产品名称、商标、标准编号、肥料登记证号、有效菌含量、生产日期、有效
期、产品性能、使用说明书及生产单位、厂址等。
93运输
适用于常用运输工具，运输过程中有遮盖物，防止雨淋、日晒及35以上高温。气温低于0时采取保温措施，防止菌肥冻冰。运输过程中轻装轻卸，避免包装破损。
94贮存
产品贮存在阴凉、干燥、通风的库房内，最适温度为10!25，不得露天堆放，以防雨淋和日晒，避免冻冰及长时间35以上高温。
以上高温。
附录A
（标准的附录）
有效活菌数和杂菌（霉菌）测定的选择培养基
A1固氮菌用阿须贝氏（Ashby）培养基
磷酸二氢钾（KH2PO4）02g
硫酸镁（MgSO4·7H2O）02g
氯化钠（NaCl）02g
碳酸钙（CaCO3）50g
甘露醇（CsH14O6）100g
硫酸钙（CaSO4·2H2O）01g
pH70
A2固氮（茎瘤）根瘤菌培养基
乳酸钠（C3H3O3Na）100g
磷酸氢二钾（K2HPO4）167g
磷酸二氢钾（KH2PO4）087g
氯化钠（NaCl）005g
氯化钙（CaCl2）004g
氯化铁（FeCl3）0004g
硫酸镁（MgSO4·7H2O）01g
酵母膏10g
（或酵母粉08g）
pH68
A3联合固氮菌培养基
D-葡萄糖酸钠（C6H11O7Na）50g
磷酸二氢钾（KH2PO4）04g
磷酸氢二钾（K2HPO4）01g
硫酸镁（MgSO4·7H2O）02g
酵母膏10g
（或酵母粉08g）
氯化钠（NaCl）01g
氯化钙（CaCl2）002g
氯化铁（FeCl3）001g
钼酸钠（Na2MoO4）0002g
pH68!70
A4马丁培养基（测霉菌数）
磷酸氢二钾（K2HPO4）10g
硫酸镁（MgSO4·7H2O）05g
葡萄糖（C6H12O6·H2O）100g
蛋白胨50g
1%孟加拉红水溶液〔四氯四碘荧光素
（C20H4ClI
44O5）〕33mL
每升培养基中加入01g氯霉素，一起灭菌。
注以上各培养基需蒸馏水1000mL，琼脂18!20g
附录B
（标准的附录）
染色剂和染色方法
B1荚膜染色法
B11染色剂
石碳酸复红染色液
甲液：碱性复红（Basicfuchsin）
（C20H20ClN3）03g
95%酒精（CH3CH2OH）100mL
乙液：石碳酸（C6H5OH）50g
蒸馏水950mL
a）将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使之溶解，配成甲液。
b）将石碳酸溶解在蒸馏水中配成乙液。
c）把甲液和乙液混合摇匀，成为石碳酸复红，通常可将混合液稀释5!10倍使用。
稀释液易变质失效，一次不宜多配。
B12染色方法
B121取少量培养菌涂于载玻片水滴中，涂成薄层。
B122自然干燥或稍加热。
B123在石碳酸复红染1min后，水洗，干后镜检。
B13染色结果
菌体为红色，菌体周围有一层透明圈即为荚膜。
B2芽胞染色法
B21染色剂
B2115%孔雀绿
孔雀绿（C23H25ClN2）50g
蒸馏水100mL
B212005%碱性复红
碱性复红（C20H20ClN3）05g
95%酒精100mL
B22染色方法
B221制片。
B222加孔雀绿染液3!5滴于涂片处，酒精灯火焰加热至冒汽，但不沸腾，并随时补加
染液，维持涂片处不干，染色约5!10min。
B223自来水冲洗30s。
B224用005%碱性复红染色1min，水洗，镜检（若005%碱性复红浓度太高，可根据
具体情况适当稀释）。
B23染色结果
芽胞绿色，菌体红色。
B3革兰氏染色法
B31染色剂
B311结晶紫染色液
甲液结晶紫（C25H30ClN3·9H2O）20g
乙醇（95%）
（CH3CH2OH）20mL
乙液：草酸铵〔（NH4）2C2O4·H2O〕08g
蒸馏水80mL
甲、乙液相混，静置48h后使用。
B312卢哥（Lugol）氏碘液
碘（I2）片10g
碘化钾（KI）20g
蒸馏水300mL
先用少量（3!5mL）蒸馏水溶解碘化钾，再投入碘片，待碘全溶后，加水100mL，配成母
液，使用时加两倍水，稀释成卢哥氏碘液。
B313脱色液：95%乙醇。
B314复染液：05%的番红水溶液
25%番红酒精溶液10mL
蒸馏水100mL
B32染色方法
B321制片。
B322滴加结晶紫液，覆盖1min。
B323用水冲净结晶紫液。
B324滴加碘液冲去残水，并覆盖1min。
B325用水冲去碘液，用吸水纸吸去水分。
B326加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30s后水洗，吸去水分。
B327番红染色液染10s后，自来水冲洗。干燥，镜检。
B33染色结果
革兰氏正反应菌体呈紫色，负反应菌体呈红色。
B4鞭毛染色
B41染色剂
甲液：丹宁酸（C76H52O46）50g
氯化铁（FeCl3）15g
甲醛（15%）
（HCHO）20mL
氢氧化钠（NaOH）
（1%）10mL
蒸馏水100mL
乙液：硝酸银（AgNO3）2g
蒸馏水100mL
待硝酸银溶解后，取出10mL备用，其余的90mL硝酸银液中滴加浓氢氧化铵，则形成很浓厚的沉淀，再继续滴加氢氧化铵到刚刚溶解沉淀成为澄清溶液为止。再将备用的硝酸银慢慢滴人，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，再滴入硝酸银，直到摇动后，仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止（如雾重，则银盐沉淀出，不宜使用）。
B42染色方法
421涂片：在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，用接种环挑取斜面上少许菌苔，在载玻片的水滴中轻蘸几下。将玻片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥B422涂片干燥后，滴加甲液染3!5min，用蒸馏水冲洗。加乙液染30!60s，并在酒精灯上加热，使其稍冒蒸气而染液不干，然后用蒸馏水冲洗，干后镜检。
B43染色结果
菌体为深褐色，鞭毛为褐色。
附录C
（标准的附录）
菌种固氮效能测定方法
在500mL三角瓶中加入100mL无氮培养基（含糖1%即1g），121灭菌30min。无菌操作，每瓶接入两环待测菌种（或1mL培养3d的培养液），放置摇床上振荡（120r/min）
30培养5!7d后，取出定糖测氮。
定糖采用蒽酮光电比色法。
测氮采用半微量光电比色法。
C1蒽酮光电比色法
C11测定原理
糖类遇硫酸即脱水成为醛类，再变成呋喃衍生物，后者与蒽酮缩合，生成蓝绿色化合物。于580!650nm处进行比色测定（蒽酮可与单糖、双糖、淀粉、糊精等反应），该方法适
合于含糖量0003%以上的样品。
C12试剂和仪器
分析中除有说明外，限用分析纯试剂和GB/T6682中规定的三级水。
C121硫酸。
C12202%（m/V）蒽酮溶液：称取02g蒽酮于100mL硫酸中。充分搅拌，使其溶解。
该溶液不稳定，应当天配用。
C123葡萄糖标准液：准确称取葡萄糖1000g，溶于水中，定容至1000mL，即为
1000mg/mL标准液。
C124分光光度计。
C13分析步骤
C131试样处理
取发酵培养的菌液100!400mL（取决于含糖量），稀释至10000ml，取此稀释液100mL于比色管中，加水至200mL，每管加入蒽酮试剂400mL，摇匀，水浴加热15min，使之充分显色，冷却后，于580!650nm处进行比色测定，记录吸光度，同时进行空白试验。
C132标准曲线绘制
吸取葡萄糖标准溶液100、200、400、600、800、1000、2000mL。于100mL容量瓶
中，加水至刻度，该液分别含糖10、20、40、60、80、100、200%g/mL。
吸取1.00mL放入比色管中，加水至2.00mL，按C1.3.1方法测定，记录吸光度用标准系列的含糖量定义横坐标，吸光度为纵坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
C14分析结果的计算
100mL溶液的含糖量（X）按式（C1）计算：
X=（m1-m2）100
m10010-6…………………………（1）
式中：m1———标准曲线上查出的试验含糖量，%g/mL；
m2———标准曲线上查出的空白试验的含糖量，%g/mL；
m———吸取发酵溶液体积，mL。
C15允许差
a）取平行测定的算术平均值为测定结果；
b）平行测定结果的允许差不大于0005g/100mL。
C2固氮菌液全氮比色测定法
C21测定原理
在硫酸铜或硫酸钾存在下，浓硫酸中加入菌液，并加热使试样全部有机氮转化为氨态氮，与奈氏试剂反应，于波长420nm处进行比色测定。
C22试剂和仪器
分析中除非另有说明，限用分析纯试剂和GB/T6682中规定的三级水。
C221硫酸（GB/T625）。
C222双氧水
C223氢氧化钠（GB/T629）2mol/L溶液：称量8g氢氧化钠溶于水中，定容至100mL。
C22440%（m/V）氢氧化钠（GB/T629）溶液：称取40g氢氧化钠溶于100mL。水中。
C22550%（m/V）酒石酸钾钠溶液：50g酒石酸钾钠溶于100mL水中。
C226奈氏试剂：71g碘化钾，10g碘化汞（HgI2）溶于少量水中，另配16g氢氧化钠溶于
70mL水中，冷却后将前一溶液缓缓倒入氢氧化钠溶液中，边加边搅拌，最后用水稀释至100mL，静置过夜，取清液储于棕色瓶中。
C227催化剂：1000g硫酸钾与100g硫酸铜共同研磨均匀，储于广口瓶中。
C228分光光度计。
C23分析步骤
C231试样制备和测试
吸取固氮菌液100mL于30mL消化管中，加硫酸（C221）3mL，加01g催化剂（C227）和5滴双氧水（C222）消煮至清亮，若反应液久煮不清，可冷却后加1!2滴双氧水（C222），继续煮至无色透明，取下冷却。加少许蒸馏水，摇匀，滴加40%氢氧化钠至出现氢氧化铜沉淀（约11!12mL），加酒石酸钾钠（C225）20滴，以去除氢氧化物沉淀掩蔽钙镁，将试管液全部转移至100mL容量瓶中，消化管洗涤液一并倒入容量瓶，稀释至刻度，摇匀。过滤，滤液1000mL于比色管中，加氢氧化钠（C223）100mL，加酒石酸钾钠100mL，加奈氏试剂3mL，摇匀，显色2!3min后，即倒入比色杯中，于420nm处比色计测定。读取吸光度。
C232标准曲线的绘制
准确称取在（1055）烘1h直至恒重的优级纯试剂硫酸铵04716g，溶于水，稀释至
100mL，该液含氮1mg/mL，取此液005、010、025、050、100、200mL。放入100mL容量瓶，用水稀释至刻度，其含氮分别为050、100、250、500、1000、2000/%g/mL，取标准液各1mL放入比色管中，加水至2mL，按C131方法测定，记录吸光度。
用标准液的氮含量为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制工作曲线。
C24分析结果的计算
氮（X）含量以g/100mL表示，按式（C2）计算
X=（m1-m2）1000
m10010-6………………………（C2）
式中m1———标准曲线上查出的试验含氮量，%g/mL；
m2———标准曲线上查出的空白试验氮含量，%g/mL；
m———吸取发酵溶液体积，mL。
C25允许差
a）取平行测定和算术平均值为测定结果；
b）平行测定结果的允许差不大于0005g。
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