可见，使用方便、经济适用、简单易行、准确可靠，适应规模化养殖的早期诊断和及时预防的需要的鉴别诊断方法为人们众望所归。为此，华中农业大学病毒研究室研制开发出猪细小病毒鉴别诊断试剂盒。

    7 诊断试剂盒研制的生物学基础

    细小病毒作为最小最简单的一类单链线状 DNA病毒，具独特的基因结构，其中多种自主型细小病毒的基因组结构非常相似。PPV具有细小病毒的一般特性，其基因组为单链线状负性DNA。其两端均为发夹结构，3’端102个碱基的回文序列被 2个大小约10个碱基的短回文序列间隔，从而形成“Y”形结构，而5’端127个碱基的回文序列，被24个碱基的短回文序列间隔，折叠成“U”形结构。PPV基因组含有两个互不重叠的主要开放阅读框架（OpenReading Frame）。位于3’端的主要编码病毒结构蛋白（VP，VP2）；5’端的主要编码病毒的非结构蛋白（NSl，NS2，NS3）。非结构蛋白的功能表现为：

    （1）非结构蛋白在细小病毒DNA复制和RNA转录过程中具有重要作用，NSl蛋白具有内切酶作用和共价结合5’端序列的特性，从而能共价结合复制型DNA5’末端并具有特意部位的解链活动。 NSl蛋白有A型保守序列，这类序列是与ATPase和GTPase相关的ATP和GTP结合位点，并具有解旋作用，它拓展了病毒DNA的末端的空间构型，起始病毒DNA的复制，所以NSl蛋白是细小病毒DNA复制所必需的。

    （2）NSl蛋白与细小病毒的组装密切相关。PPV新合成的单链DNA基因组的5’端通过共价键与NSl联结，在随后的病毒包装过程中NSl被去掉并连在病毒粒子的外层。

    （3）非结构蛋白NSl具有抗原性，并刺激机体产生抗体。NSl虽然是微量的，但在病毒复制中，能持续刺激机体产生抗体。当猪感染PPV后，体内将产生抗NSl的抗体，而使用灭活苗免疫的猪则没有这种抗体一基于此，利用杆状病毒体外重组表达的NSl建立了区分PPV野毒感染和灭活疫苗免疫猪的鉴别诊断方法

    8 诊断试剂盒研制的过程

    本研究在对PPV中国株的NSl基因进行PCR扩增、克隆和序列测定的基础上，进一步对细小病毒进行了深入研究，利用大肠杆菌表达系统成功表达了PPVNSl蛋白作为抗原，建立间接ELISA诊断方法。

    通过大量临床血清的检测证实：

    （1）特异性实验：用NSl包被微孔板，分别检测猪口蹄疫、猪伪狂犬等猪的阳性血清，检测结果都呈阴性。表明，此诊断方法对猪细小病毒病的检测具有特异性，是一种准确而使用简便的诊断方法。

    （2）稳定性实验证实诊断试剂盒在室温下放置的有效使用期可以达到5个月。

    （3）灵敏性实验证实其比常规的诊断方法，如HI和LAT等更为灵敏，尤其可以鉴别诊断自然感染和灭活苗免疫猪群。

    （4）此诊断方法对于大量血清检测具有省时、便捷、准确的特点，更适应规模化养殖的早期诊断和及时预防的需要。