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转基因油菜研究进展


油菜是重要的油料作物,对油菜的改良是育种家们长期努力的目标。据报道,1998年全球转基因油菜种植面积为240x104hm2占全球油菜种植面积的9%,1999年增至280x104hm2,占全球油菜总面积的11%,2000年全球转基因作物面积为4420x104hm2,占全球作物种植面积的16%(官春云,2002)。多年来,许多育种工作者试图采用传统的育种手段来获得油菜良种,但进展十分缓慢。随着基因工程技术的发展,人们愈来愈倾向于通过基因工程的手段改良油菜的产量、品质及抗逆性。因此,建立良好的油菜转化体系至关重要。

  1油菜转基因的受体系统及筛选标记

  1.1受体系统

植物转基因受体系统是指选择合适的器官、组织或细胞进行转基因后,能通过组织培养或其它途径再生出新生植株的无性繁殖体系。因此,适宜的油菜转基因受体系统的建立,是创造转基因油菜的关键环节。

  1.1.1子叶、下胚轴受体系统

  Moloney等(1989)年发现芸薹属植物种子萌发以后,切取带有1-2mm子叶柄末端切口处的细胞不但再生能力强,而且易被农杆菌感染和转化。近年来,国内外许多学者分别以油菜的子叶、下胚轴、茎段为受体进行基因转化。Pua等(1987)建立了茎段再生体系,并以此为受体,转化率为10%。Moloney等(1989)以叶柄为受体的转化率为55%。以子叶、下胚轴、茎段为受体,具有简便、快速、转化率高f1.5%~55%)等优点。但再生植株易为嵌合体,基因型也可能是杂合的(段英姿等,2003)。

  1.1.2原生质体受体系统

  自1972年第一株烟草体细胞杂种植株问世以来,原生质体融合技术在不断完善和发展。油菜的原生质体培养起步于20世纪70年代,到目前为止,在栽培油菜的3个种中都利用原生质体培养获得了再生植株(Chieneta1,1982;Glimeliuak,1984;Puite,19921。以原生质体为受体能得到高度纯合体,但其再生及分化困难,转化频率较低,且操作复杂(段英姿等,2003)。

  1.1.3小孢子受体系统

  油菜小孢子培养和再生技术,在国内外已经发展的比较成熟。小孢子本身具有单细胞性和单倍体双重特点。因此用它作为转化受体进行外源基因导入,不仅有利于基因表达还可以加速转基因材料的纯合,而且可缩短育种年限。陈军等(1998)以“中双1号”、“中双3号”、“中油821”、“89008”等油菜品种,建立了甘蓝型油菜游离小孢子再生胚状体的实验体系,掌握了受体最佳发育时期,使再生频率高达每花蕾21.2个胚状体,并以此为受体得到转基因植株。

  1.2筛选标记

  在植物转基因工程中,如何选择和筛选转化体是一个重要的问题,在油菜转基凶工程中应用到许多选择标记基因和报告基因,使人们能快速、准确地从大量非转化体中获得转基因植物。油菜较常用的筛选标记基因有新霉素磷酸转移酶基因(NPTII),潮霉素磷酸转移酶基因(程振东等,1994)和二氢叶酸还原酶基因(Puaeta1,1987)及bar基因、Bt基因(卫志明等,1998),它们分别介导对卡那霉素、潮霉素、氨基喋呤、除草剂、巴龙霉素的抗性。至于哪一种效果最好一定程度上取决于基因型和可利用的转化载体,研究表明对不同基因型的筛选效果亦不同。筛选剂最常用的是卡那霉素,应用卡那霉素筛选不乏成功的报道,但有的学者认为(Puaeta1,1987),卡那霉素对于甘蓝型油菜来说,有时效果很差,这可能与基因型有关。潮霉素、庆大霉素、新霉素应用成功报道亦不少。Schr~der等(1994)研究了在甘蓝型油菜转化过程中4种选择标记基因(nptⅡ,aadA,bar,Spt)在筛选过程中的效果,认为用aadA基因(介导对链霉素和壮观霉素的抗性)作为标记对转化体进行筛选最合适。

  2油菜转基因方法

  在植物基因工程研究中,关键步骤之一是通过特定的方法将外源基因导入受体植物细胞内,使之发生定向的、永久性的遗传变异,即所谓的植物遗传转化。为了方便有效地将外源基因导入植物体内,人们不断地探索、发展新的植物遗传转化方法。目前应用到油菜转基因中的遗传转化方法主要有农杆菌介导转化法和外源基因直接导入法。

  2.1农杆菌介导转化法

  农杆菌在侵染植物伤口时,可将其携带质粒上的一段DNA(T-DNA)整合到植物基因组上,并在植物体内表达。因此,农杆菌作为一种天然载体系统被广泛应用到植物基因转化中(表1),成为植物基因转化的首选方法。农杆菌介导的转基因方法具有以下优点:不需要专门仪器;宿主范围广,包括大多数双子叶植物和少数单子叶植物;插入外源基因的片段较大,可达50Kb以上;转化率明显高于其它直接转化方法;外源基因整合到植物基因组上的拷贝数较少,多为单拷贝;整合的外源基因变异小,后代的分离规律也遵循孟德尔遗传规律。缺点是仍受宿主范围和菌株特异性等因素的限制(Santar6meta1,1998;TrickandFiner,1998)。


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