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猪繁殖与呼吸综合征的诊断技术(下)


⑶血清学检查

①免疫过氧化酶单层细胞试验(IPMA):将肺泡巨噬细胞加入微量滴定板各孔内,待细胞吸附着后,接种PRRS病毒,使每孔仅30%~50%细胞感染,以区别非特异性血清。经过孵育,细胞固定,用于血清学试验,每个血清板可用于11个双份血清检测。稀释被检血清,并在细胞上培养,如果试验血清中存在抗体,即与巨噬细胞胞质中的抗原结合。在第二次培养阶段,结合的抗体可用抗种的辣根过氧化酶(HPPO)结合物测定。最后,细胞与显色液/底物溶液共同培养。用倒置显微镜判断结果。这种方法特异性强,可测出感染后1~2周至12个月的抗体。

②间接荧光抗体试验(IFA):荧光抗体试验是美国、日本、加拿大等国常用的血清学检测方法,抗原制备与免疫过氧化物酶细胞单层试验相同,可检测出感染后2~28天的IgM抗体,血清抗体效价低于1∶20者为阴性。

③酶联免疫吸附试验(ELISA):ELISA具有高度的特异性和敏感性,方便易行,操作过程和结果判断能标准化,且适用大规模的检测,法国目前已把ELISA法作为监测和诊断本病的常规手段。ELISA方法比IPMA方法能更早的检测出抗体。该方法可测定感染2周病毒后的抗体。其中,间接ELISA用于检测血清中抗体,PRRSV抗体,也可检测抗原。阻断ELISA(blockingELISA)法可大批量检测血液样品中的PRRSV抗体。阻断ELISA的敏感性和特异性最高。与另外两种方法相比,它成本较低廉,也更易于大面积推广。

④血清中和试验(SN):本法主要用于检测PRRS抗体,具有良好的特异性,中和抗体的持续期比前两种方法都长,在病毒和待检血清混合物中加入20%猪血清以添加补体成分,并改变作用温度和作用时间,可以提高其敏感性。但血清中和试验需要进行细胞培养,费时费力,实验要求较高,猪感染PRRSV后,中和抗体出现较晚,所以在感染早期和急性感染的诊断中敏感性会下降。Morrison等(1992)用CL-2621细胞建立了SN试验方法,与IPMA和IFA相比,SN检出中和抗体较晚,Yoon等(1994)改良了SN试验方法,可在人工感染后11天检出中和抗体。鉴于采用同源毒株和异源毒株进行SN试验测得的中和抗体效价不同,而且SN方法费时费力,不适用于常规诊断。

⑷原位杂交法

进行原位杂交的cDNA探针主要是针对PRRSV-ORF7设计的,可以在肺、淋巴组织、肺泡巨噬细胞、淋巴结、肾脏的感染细胞内检测到PRRSV,其敏感性高于免疫组化法和免疫胶体金技术,检出的持续时间更长。此外,能够对PRRSV在体内器官中的动态分布情况进行追踪检测。根据不同基因型PRRSV的核酸序列设计合成不同的探针可区别不同基因型PRRSV的感染,将不同基因型的探针混合后进行原位杂交,则不同基因型的感染都可检出。


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