近年来，有关传染性支气管炎病毒变异株引起肌肉、肠道，甚至腺胃等非呼吸、生殖和泌尿系统的组织、器官发生病变的报道不断出现。但其中大部分尚待进一步证实。因为现有的研究数据表明，除IBV毒株本身的致病作用外，环境中的一些诱因（如寒冷、饲料成分不当、滥用药物、多种病原混合感染等）对传染性支气管炎病变的表现形式和严重程度有很大影响。如果将异常的临床表现或病理变化都归究于IBV毒株变异本身，则容易对诊断和防制工作带来不利的影响。

根据本病的临床特点、病史、症状表现和病理变化，可作出初步诊断。确诊则需要借助于病毒学、血清学和分子生物学等一系列实验室检测方法。
　　（一）病毒分离 常用于病毒分离的材料包括病鸡的喉头分泌物和泄殖腔内容物（用无菌棉拭子蘸取）、气管、肺组织和肾脏等。将新鲜病料（组织块需磨碎），按1∶5～1∶10加入灭菌磷酸盐缓冲液制成组织悬液，离心取上清，加适量抗生素于4℃冰箱内感作2h～4h。然后接种于9～11日龄SPF鸡胚或非免疫健康鸡胚的尿囊腔内，37℃孵育36h～48h，取出部分鸡胚，收获尿囊液进行血清学或分子生物学检测，其余鸡胚继续孵化6d～7d，观察胚体变化。如病料中有传染性支气管炎病毒，则部分鸡胚在接种后3d～5d发生死亡，胚体比同日龄正常鸡胚矮小，卷成球形，又称“侏儒胚”。羊膜及尿囊膜增厚，胚体充血。初次分离的野毒往往要经过鸡胚盲传2～3代后，才能见到明显和规律的鸡胚病变。此外，也可通过鸡胚气管环培养法分离IBV。
　　（二）病毒鉴定
　　1.干扰试验 IBV在鸡胚中能够干扰NDV-B1株（即新城疫II系疫苗株）产生血凝素，因此，可利用这种方法对IBV进行鉴定。具体做法是：取9～11日龄SPF或无母源抗体的鸡胚10～20只，分成两组。其中一组先通过尿囊腔内接种经无菌处理的病料，每只鸡胚0.1ml，另一组作为对照，不接种。孵化10h后，两个组同时经尿囊腔途径接种含NDV-B1株的鸡胚尿囊液，每只鸡胚0.1ml。继续孵化36h～48h后，把两组所有鸡胚置4℃冰箱内4h以上，然后逐只收获并测定尿囊液的血凝效价。若病料中确实存在传染性支气管炎病毒，则该组鸡胚有50％以上的血凝效价在1:20以下，而对照组的鸡胚则有90％以上的血凝效价在1:40或以上。整个试验要严格按上述规定时间去做，否则干扰作用就会减弱或消失。
　　2.血清学试验 常用于鉴定IBV的血清学方法包括病毒中和试验（VN）和免疫荧光抗体技术（IFA）等。但由于IBV的血清型很多，而对大多数实验室来讲很难制备或获得全套的型特异性标准阳性血清。因此，目前主要通过血清学方法判断分离物中是否含有IBV。
　　3．分子生物学试验 一般根据IBV基因组RNA的保守区段（如3’末端）设计引物，通过反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）或反转录－巢式聚合酶链式反应（RT-nested PCR）扩增特异的基因片段。这个方法灵敏、快速、特异，能够较好地避免IBV血清型众多所造成的不便。因此已被许多实验室接受并投入临床样本检测。另外，也有通过核酸探针进行诊断的报道，但其操作不如RT-PCR方便。
　　（三）人工发病 将感染性的鸡胚尿囊液通过气管内接种或点眼感染方式，接种1日龄SPF雏鸡或无母源抗体的健康雏鸡。经18h～36h后，接种鸡会出现明显的症状和病理变化。本方法在气温较低的冬春季节进行，较易获得成功。另外，由于临床上有多种因素会影响本病的症状表现，所以建议人工发病时最好配合病理组织学检查做出诊断。
　　（四）血清学诊断 对本病的血清学检验方法有病毒中和试验（VN）、琼脂扩散试验(AGP)、血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。
病毒中和试验：用病毒中和试验可对传染性支气管炎病毒进行定性和定量检验。试验方法有鸡胚（7～11日龄）法、鸡肾细胞培养法和蚀斑法3种。鸡感染传染性支气管炎病毒后约10d（疾病流行过后的恢复期），其血液内出现中和抗体，并可持续6～12个月。因此，对患病鸡群的检验，通常采双份血清样，第一次是在发病初期，第二次是在发病后2～3周。若第二次血清样抗体滴度比第一次高出4倍，即可诊断为鸡传染性支气管炎感染。
琼脂扩散试验：可用感染鸡胚的绒毛尿囊膜制备抗原，也可用聚乙二醇浓缩感染鸡胚尿囊液制备抗原，按常规方式完成试验，经24h～48h观察结果。此法特异性较强，操作方法简单而快速。鸡感染IBV野毒或接种弱毒疫苗7d～9d后就能检出沉淀抗体，并可持续2～3个月。一般认为雏鸡血清中和指数在3.17以上时，就能用琼扩试验测出沉淀抗体的存在，因此采用AGP试验对疫苗接种效果的监测有现实使用意义。