[作者:张日俊,中国农业大学饲料生物技术实验室主任]

3 微生态制剂的科学合理使用及注意问题

微生态制剂具有无毒副作用、促进动物生长、提高饲料转化率、可替代抗生素等优点。但由于存在菌种的筛选、活菌数、菌种的失活、杂菌含量的多少、使用条件等问题而导致微生态制剂活性降低，使用效果的重复性和稳定性较差或时好时坏等。因此在养殖生产或饲料生产中为了确保微生态制剂的使用效果，应科学合理使用，并从以下几方面着手。

3.1 菌种的选择

3.1.1 菌种的来源 在微生物的大家族里，可选作微生态制剂的菌种很多，包括细菌、真菌及多来自土壤、腌制品、发酵食品以及动物消化道和粪便的无毒菌株。美国食品药物管理局（FDA）和美国饲料公定协会（AAFCO）公布了40余种“可直接饲喂且通常认为是安全的微生物（GRAS）”作为微生态制剂的出发菌株，其中：①乳酸杆菌属（Lactobacilleae）：短乳杆菌（L. Brevis）、嗜酸乳杆菌（L. Acidophilus）、保加利亚乳杆菌（L. Bulgaricus）、干酪乳杆菌（L.Casei）、纤维二糖乳杆菌（L. Cellosus）、弯曲乳杆菌（L. Curvatus）、德氏乳杆菌（L. Delbruekii）、发酵乳杆菌（L. Fermentum）、罗特氏乳杆菌（L. Reuterii）、乳酸乳杆菌（L. lactis）、植物乳杆菌（L. Plantarum）。②双歧杆菌属（Bifidobactirium）：青春双歧杆菌（B. adolescentis）、婴儿双歧杆菌（B. infantis）、动物双歧杆菌（B. animalis）、长双歧杆菌（B. longum）、嗜热双歧杆菌（B. thermophilum）、两歧双歧杆菌（B. bifidum）。③肠球菌属（Enterococcus）：粪肠球菌（E.faecalis）又称粪链球菌（S. faecium）、屎肠球菌（E.faecium）又称屎链球菌（S. faecium）。④链球菌属（Streptococcus）：嗜热链球菌（S. thermophilus）、乳酸链球菌（S. lactis） 又称乳酸乳球菌（L.lactis）、中间型链球菌（S. intermedius）、乳脂链球菌（S. cremoris）、二丁酮链球菌（S. diacetylactis）。⑤芽孢杆菌属（Bacillus）：凝结芽孢杆菌（Bacillu coagulans）、缓慢芽孢杆菌（B. lentus）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、地衣芽孢杆菌（B. lincheniforms）、短小芽孢杆菌（B. pumilus）。⑥明串珠菌属（Leuconostoc）：肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）。⑦片球菌属（Pediococcus）：乳酸片球菌（Pediococcus acidilacticii）、啤酒片球菌（P. cerecisiae）、戊糖片球菌（P. pentosaceus）。⑧乳球菌属（Lactococcus）：乳酸乳球菌（L.lactis）又称乳酸链球菌（S. lactis）。⑨丙酸杆菌属（Propionibacterium）：谢氏丙酸杆菌（P.shermanii）、费氏丙酸杆菌（P. Freudenreichii）。⑩拟（类）杆菌属（Bacteroides）：猪拟（类）杆菌（B. suis）、瘤胃生拟（类）杆菌（B. ruminocola）、多毛拟（类）杆菌（B. Capillosus）、嗜淀粉拟（类）杆菌（B. amylophilus）。{11}酵母菌属（Yeast）：啤酒酵母或酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。{12}曲霉菌属（Aspergillus）：黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（A. oryzae）。

我国农业部1999年6月公布（105号公告）了干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪链球菌、屎链球菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、乳链球菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母和沼泽红假单胞菌12种可直接饲喂动物、允许使用的饲料级微生物饲料添加剂菌种，并在生产实践中表现出良好的生产性能。此外，在国内外还陆续有新的应用菌种的报道，如环状芽孢杆菌（B.circulans）、坚强芽孢杆菌（B.firmus）、巨大芽孢杆菌（B.megaterium）、丁酸梭菌（Clostridium butyicum）、芽孢乳杆菌（L.sporogenes或sporolactobacillus）等。从动物生产和饲料工业角度来评价，芽孢杆菌类有益微生物较其它微生物具有更多优点，因而对其研究和应用更加广泛。

3.1.2 菌种的安全性 作为微生态制剂，菌种的安全性或非病原性是筛选菌种的首要条件，即使促生长或者其它生产性能再好，病原菌绝对不予考虑。因此，必须确定出发菌株的安全性，并且对该菌种可能的代谢产物进行系统的研究。值得注意的是，一株现在无毒副作用的菌种，将来也可能会因为理化、微生物毒素和菌种本身原因引起负性突变，所以应定期对生产菌种进行安全性检测或评价。

评价菌种的安全性包括致病性、感染性、毒力或毒素、代谢活性以及菌株的遗传特性。国外学者提供了一些评价乳酸菌安全性体外研究的方法，可以借鉴。

3.1.2.1 对益生菌致病性和感染能力的检测 没有致病性、感染性应该是益生菌安全性必须具备的条件。要证明益生菌是否具有感染性很困难，特别是厌氧菌。对弱感染力的细菌，即使给健康动物大量口服也不会引起感染。通常需要多种条件共同参与，才能建立起感染。一般采用抗生素脱污染或口服免疫抑制剂等方法，造成动物的菌群屏障功能和免疫功能丧失，再喂给微生态制剂，检查其是否引起感染。另外，采用无菌动物或悉生动物检查益生菌的感染也是可以使用的方法。有的益生菌可能引起定位转移，也是一种感染的表现，国外有学者将悉生小鼠口服长双歧杆菌BB536菌株2~3d后发现，细菌在肠内容物上的含量是10～100亿个/g。在1～2周后长双歧杆菌发生定位转移到肠黏膜淋巴组织、肝脏、肾脏，4周后全部消失。说明定位转移未能引起任何感染和毒副作用发生。采用悉生动物研究实验方法研究益生菌安全性是评估益生菌安全性和功效原理的有效方法，但这需要良好的试验研究条件，对于一般的用户是难以进行该方面评价的。

3.1.2.2 益生菌代谢活性、有毒物产生的检测 评价微生态制剂安全性的另一个方面是检测益生菌是否产生有毒代谢产物及有害酶类，如发酵蛋白质产生氨、吲哚、酚、胺基、硫化氢等物质。目前还没有双歧杆菌和乳酸杆菌能够产生有毒物质的报道。检测发现双歧杆菌具有较低的脱胺酶活性和有较高的同化氨的能力，同时对胆汁酸具有较强的脱饱和能力。检查益生菌毒性的常规方法一般用急性毒性试验（即一次性大剂量口服微生态制剂）和慢性毒性试验（即多次小剂量给试验动物口服微生态制剂）。作者曾给试验动物大鼠多次皮下注射（左右侧每次各10ml，每月一次）由乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌组成的微生态制剂，历时1年半后，其生理状况十分健康，解剖后未发现任何脏器有异常变化。这也是评价益生菌安全性的方法。

3.1.2.3 血小板凝集活性、黏膜脱落活性 有些细菌产生的血小板凝集反应，被认为是促进感染心内膜炎的因素。有学者检测从心内膜炎感染分离到的5株鼠李糖乳酸杆菌和16株实验室内鼠李糖乳酸杆菌，发现从感染部位分离到的菌株全部具有血小板凝集反应，而实验室菌株只有一半具有此反应。凝集反应与细菌细胞外层蛋白结构有关。由感染部位分离到的菌株比实验室内的鼠李糖乳酸杆菌具有更强的凝集能力。某些菌株可以产生使黏膜细胞表面糖蛋白脱落的糖苷酶（ylycosidases）或芳香氨基酶（arylamidase）而引起感染，检测这些酶即可确定是否具有毒性或感染性。

3.1.2.4 抗生素耐药性 耐药性菌株的产生是人们广为关注的问题，已经发现从感染部位分离到的肠球菌已出现多重耐药性，即同时耐受多种抗生素。菌株耐药性的产生可以由使用抗生素的选择作用而产生，也可以由具有耐药性的细菌转导产生。关于天然具有抗生素耐药性的双歧杆菌和乳酸杆菌已有报道。为了避免具有耐药因子的菌株向肠内细菌转导耐药因子，益生菌株不应携带耐药因子。虽然某些特殊目的的益生菌株可以具有一种或多种抗生素耐药性，但通常情况下不应设计这种具有多重抗药性的菌株。人们常提到肠球菌的耐药性问题，特别是质粒编码因子能否把耐药因子传给正常菌群或病原菌。有试验表明，罗特乳酸杆菌（L. reuteri）可将耐药因子传给屎肠球菌或粪肠球菌，但是这种传递是在抗生素的选择压力下产生的，不使用抗生素并未发现耐药性质粒的传递。耐药性传递，不仅肠球菌，其它益生菌菌株都可能发生。世界各国生产的酸奶制品所用的乳酸杆菌、双歧杆菌及链球菌大部分都有耐药性。这些菌是动物和人类长期历史进化过程中形成的正常微生物群落，在自然情况下本来就可以互相转移。如果没有其它选择性压力因素存在，作为益生菌剂传播耐药性的忧虑是没有必要的。目前由益生菌耐药性所导致的危害还未见报道。

3.2 针对不同的畜禽和不同生长阶段，选择使用微生态制剂 在使用微生态制剂的同时要充分考虑到使用对象和目的，对不同的动物要区别对待，不同种类的动物消化系统的特点不同。因正常菌群在动物消化道内定植是通过细菌的粘附作用完成的，这种粘附作用具有种属特性，对某一类动物的消化道上皮表现出较强的粘附性，而对其它动物可能表现出低粘附性或不粘附性。如防治1～7日龄仔猪腹泻首选植物乳酸菌、乳酸片球菌、粪链球菌等产酸的制剂；而促进仔猪生长发育、提高日增重和饲料报酬，则选用双歧杆菌等菌株。因此，在实际生产中应根据不同的需要选择合适的制剂，预防动物常见疾病主要选用乳酸菌、片球菌、双歧杆菌等产乳酸类的细菌，效果会更好；促进动物快速生长、提高饲料效率，则可选用以芽孢杆菌、乳酸杆菌、酵母菌和霉菌等制成的微生态制剂；如果以改善养殖环境为主要目的，应从以光合细菌、硝化细菌以及芽孢杆菌为主的微生态制剂中去选择。不同的畜禽、不同的生长发育阶段、不同的用途也需要有选择性的添加由不同益生菌组成的微生态制剂，具体参照表1进行。

3.3 微生态制剂的应用条件或环境 如何保持菌种的稳定性是从事微生态制剂研究和生产面临的最实际的问题。对微生态制剂而言，主要指对特定环境的耐受力如温度、湿度、酸度、机械摩擦和挤压以及室温条件下的存贮时间等对微生态制剂活性的影响；而对饲用微生态制剂必须经受饲料加工过程中高温的考验，所以菌种对温度的稳定性显得尤为重要。不同的菌种对高温的耐受力差异较大，芽孢杆菌耐受力最强，100℃下2min只损失5%～10%，而在80℃下5min乳酸杆菌、酵母菌损失70%～80%；95℃下2min损失98%～99%。一般制粒温度80～90℃对芽孢杆菌影响较小，对乳酸杆菌、酵母菌和粪链球菌等影响较大。就耐水性，孢子型细菌耐受性最好，肠球菌次之，乳酸杆菌最差。除耐酸性的芽孢杆菌和乳酸菌外，一般的活菌制剂在胃酸作用下大量被杀死，残存的少量活菌进入肠道后很难形成菌群优势。因此，不耐酸的活菌制剂其含菌量必须达到相当大的浓度才能发挥益生作用。除此以外，饲料的保存时间、饲料中的矿物质（如重金属离子Cu2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+等和食盐）、胆碱和不饱和脂肪酸也会影响益生菌的活力。

为了提高微生态制剂的稳定性和活力，目前国内外采用微胶囊化技术或包衣技术。微胶囊化技术是当今世界发展迅速、用途广泛而又比较成熟的一种技术。制备微胶囊的过程称为微胶囊化（microencapsulation），它是将固体、液体或气体包裹在一个微小的胶囊中。包封用的壁壳称为壁材，被包的囊芯称为芯材，芯材可以是单一的，也可以是复合的。囊壁厚度一般为0.1～200μm之间，微胶囊的粒子大小，因制备工艺及用途不同而不同，理论上可以制成0.01～1 000μm的微胶囊。常用制备微胶囊的方法有：相分离法、界面聚合法、喷雾冷却和喷雾干燥法、挤压法、双重乳状液法。将乳酸菌或一些低抗逆性的益生菌进行微胶囊化包被的优点在于：①可将菌体与外界的不良环境分开，免受微量元素的损害，减缓制粒过程中温度和压力的影响。②形成固体微颗粒，利于在预混料中的均匀分布，也有利于储存和运输。③采用肠溶性壁材后，还能防止胃液的破坏，从而使尽可能多的菌体到达肠道，真正起到保健和治疗的作用。因此，微胶囊化有望提高乳酸菌在生产、贮存和消费过程中的稳定性，生产出耐贮存、耐高温、耐高压、耐酸性的乳酸菌微生态制剂。中国农业大学饲料生物技术实验室在国家“863”高科技项目和国家“跨越计划”的资助下，成功研发了利用喷雾干燥法制备乳酸菌微胶囊的技术，并申请了国家发明专利。国外进入我国市场的有瑞士的粪链球菌微胶囊“赐美健”、荷兰的“百福菌”等，但是价格很高。因此，研究对乳酸菌等低抗逆性微生物进行微胶囊化包被，并提供一条适用的工业化途径，使其稳定性增强，贮存期延长，使这种低抗逆性微生物添加剂可以与其它饲料原料共存、共用，将有广阔的前景。

3.4 活菌浓度和使用剂量 微生态制剂的功效是通过有益微生物在动物体内的一系列生理活动来实现的。其最终效果同动物食入活菌的数量密切相关。若数量不够，在体内不能形成优势菌群，难以起到益生作用。瑞典规定乳酸菌制剂活菌数要达到2×1010个/g。我国正式批准生产的制剂中，对含菌数量与用量的规定是：芽孢杆菌含量≥5×108个/g；乳酸杆菌≥1×107个/g。德国学者认为，仔猪饲料中加入微生态制剂其含菌量应达到2×105～5×105个/g；育肥猪饲料中每克加入106个芽孢杆菌，粪中大肠杆菌减少35%，每天添加0.5～0.6g微生态制剂方可起到治疗效果。而乳酸杆菌因制剂不同而有差异，其数量不少于107个/g，每日添加0.1～3g，一般添加量为0.02%～0.2%。若将微生态制剂添加于饲料中，其目标活菌不应低于109个/kg。但是，关于添加过量的益生菌产生的后果，鲜有报道，根据作者的研究结果，每千克断奶仔猪饲料中添加6×1011个枯草芽孢杆菌，其促生长效果差于最适添加量，但好于不添加组的效果。

3.5 微生态制剂与抗生素的配合应用 由于微生态制剂是活菌制剂，而抗生素具有杀菌作用。因此，一般情况下，在畜禽饲料中不可同时应用，若同时应用时，微生态制剂的功效将大大减弱。但我们仍可以巧妙地利用某些抗生素，如当肠道中存在较多的病原体，而微生态制剂又不能取代肠道微生物时，会降低其抵抗力，或使用某些微生态制剂补充特定的正常菌时，对过盛的种群，可利用窄谱抗生素予以控制。对于肠道菌群紊乱或菌群调整不奏效的病例，可在用抗生素后用微生态制剂，即先选用肠道不吸收的针对性较强的广谱抗生素如新霉素、卡那霉素、制霉菌素口服杀灭或抑制致病微生物的繁殖，控制疾病的蔓延。但抗生素在杀灭致病菌的同时，动物体内的正常菌群也遭到破坏，此时应及时引入微生态制剂，通过其益生作用，使其紊乱的肠道菌群恢复平衡。对于抗生素和微生态制剂的结合使用效果并不能一概而论，两者联合使用时应考虑组成微生态制剂的每个种菌对特定抗生素的敏感性、动物品种及年龄等的影响。只有根据微生态制剂的菌种组合及特性以及抗生素的种类和作用对象进行合理配合，才能达到预期结果。

3.6 使用时间 微生态制剂在动物的整个生长过程中都可以使用，但不同的生长时期其作用效果不尽相同。一般在动物幼龄阶段，体内微生态平衡尚未完全建立，抵抗疾病的能力较弱，此时引入益生菌，可较快地进入体内，占据附着点，效果最佳。如新生反刍动物肠道内有益微生物种群数量的增加不仅可以促进宿主动物对纤维素的消化，而且有助于防止病原微生物侵害肠道。另外在断奶、运输、饲料转变、天气突变和饲养环境恶劣等应激条件下，动物体内微生态平衡遭到破坏，使用微生态制剂对形成优势种群极为有利，因此，把握益生菌的应用时机，尽早并长期饲喂，使其益生菌的功能得到充分体现。

3.7 使用方法 一是连续使用，二是阶段性使用，三是在某些阶段一次性使用。具体使用方法，以中国农业大学国家“863”项目和国家“跨越计划”项目研制的益生康为例，具体说明见表2。

4 结束语

微生态制剂替代抗生素应用于饲料中,避免了长期使用抗生素的种种副作用,并具有促进动物生长，提高饲料报酬以及防治疾病等功能。但它在实践生产中的使用效果也不完全一致，而是受到许多因素的影响和制约。一方面是因为某些微生态制剂产品本身存在缺陷，质量差、以次充好；另一方面是由于错误的使用方法所致。因此，要正确选择高品质的微生态制剂，了解其特性，掌握科学合理的使用方法，可最大程度地发挥微生态制剂功效和优越性。