摘　要：近年来，用灭活疫苗免疫接种已成为我国控制禽流感的一种主要策略，但免疫禽类不能与自然野毒感染的禽类从血清学水平上进行鉴别，并常导致贸易障碍。为了克服禽流感灭活苗的这种局限性，提出对疫苗免疫和野毒感染禽类鉴别诊断。一是免疫群内安插未免疫过的“哨兵禽”，二是采用亚单位疫苗免疫定向检测血凝素蛋白，三是接种疫苗的血凝素与野毒同源而神经氨酸酶为异源，四是检测非结构蛋白(NS1)的血清学反应。文章对上述四种鉴别诊断策略的优缺点进行了评价，为禽流感的控制策略提供一些新的思路。

关键词：禽流感；鉴别诊断；非结构蛋白；血凝素；神经氨酸酶；抗原漂移

对许多疫病来说，接种疫苗的主要目的是为了预防或降低由病原引起的临床疾病。然而，接种疫苗有时也可以成为一种控制措施，根除来自某一地区或某一群体的病原^[1-2]。例如，禽传染性支气管炎和猪、马、牛的流感，接种疫苗通常只是为了消除由病原体引起的临床症状。在这四个例子中，病毒在易感群体中分布广泛并且呈高度传染性，要想实现彻底根除是非常困难的。接种疫苗可以被当作一种成功的控制措施，将引起某种疾病的特定传染源拒之于一个国家或某个地区之外^[3-5]，如口蹄疫或家畜的布鲁菌病。对家禽来说，接种流感疫苗对于根除来自某一地区或群体中的病毒也是一种成功的控制方法。

对一种疫苗来说，作为一种有效的控制工具必须具备三个特点：①能降低或防止临床感染。②能在已感染禽体内降低或清除病毒颗粒的排放，防止病毒传播到非感染群。③接种疫苗应该能增强禽类对感染的抵抗力。

降低排毒量和增强对感染的抵抗力，这两种方式均能打破禽流感的传播循环^[2]，从而达到控制和根除禽流感的目的。

接种疫苗具有某些优点，但同时也存在一些潜在的缺点。首先就是接种疫苗的成本，因为禽类个体的价值特别是小鸡是非常低的，这在疫苗接种方面就造成了很大的阻碍。在美国，大多数的家禽在孵化所里就开始接种疫苗，同时还采取大规模的接种方式(喷雾或给水途径)，这样可使接种疫苗的成本降低。对禽流感来说，目前主要是大量使用灭活佐剂疫苗或禽痘重组载体疫苗，灭活疫苗在家禽的禽流感中的使用最广泛，一般采取皮下注射，其停药期较长。

接种疫苗的第二大局限是对国际贸易的影响。接种疫苗一般是为了消灭疾病，应该是不会受到贸易制裁或限制的，但是在过去接种疫苗会产生一种错觉，那就是传染病会在接种疫苗的国家蔓延，并且对家禽或家禽产品实行非关税的贸易壁垒。增强诊断检验的能力，通过加热或在某些情况下使用疫苗来处理产品也能确保其安全性。

接种疫苗的第三个缺陷是它对血清学监测造成了影响。在美国经常对禽流感进行血清学监测，是国家家禽改进计划和其他监测程序的重要组成部分，这种血清学监测保证了畜禽免受禽流感的侵袭。现在使用的灭活疫苗能对细胞的结构蛋白产生可检测的抗体，这些蛋白包括基质蛋白和核蛋白，这两种蛋白在琼脂免疫扩散试验(AGID)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等一般的抗体检测试验中都可以产生A型特异性抗体。因此，接种疫苗禽类就不能和自然野毒感染禽类区分开了，这降低了血清学监测的作用。

接种禽流感疫苗的第四个缺点是抗原漂移，其血凝素基因积聚性的点突变使疫苗的保护性大大降低。抗原漂移是人、猪和马流感的关注要点，使得疫苗要不断更新。抗原漂移被认为是野毒在宿主体内受到免疫压力所致，接种疫苗或自然野毒感染都可能产生抗体压力，病毒将在压力下进行选择来逃避免疫反应，使得病毒在宿主体内大量复制，产生较高的病毒滴度量^[6-7]。病毒进一步复制，病毒的应变能力增加导致能传播到其他易感宿主。直到现在，人们才认识到禽流感病毒抗原漂移问题的重要性，最近在墨西哥、危地马拉和萨尔瓦多的疫苗试验表明，抗原漂移已经成为一个很严重的问题。

尽管接种疫苗能影响血清学监测，并且不利于国际贸易，但现在仍然认为接种疫苗能更经济有效的扑灭禽流感。在生产实践中为了控制禽流感，要进行血清学监测，重要的是不仅要区分禽流感疫苗感染和和野毒感染，而且必须鉴别疫苗接种的动物是否感染了禽流感^[10-11]。四种不同的鉴别疫苗免疫和野毒感染禽流感的措施就是为了克服这个难题，但是每一种措施都有其各自的优点和缺点，这些策略包括“哨兵家禽”、亚单位疫苗、异源神经氨酸酶和非结构蛋白(NS1)策略。每一种策略必须在其所适用的范围内加以应用^[8-9]。

1　哨兵家禽

使用非免疫的哨兵家禽进行监视，这是一种传染病监测的普通策略，它能判断畜禽是否可能感染了禽流感。一般是选取具有代表性的30只或更多的家禽，做上标记，随意放置于疫苗免疫过的群体内，定期进行禽流感的检测。哨兵家禽对接种疫苗的畜禽提供了一种敏感的监测方法，这种策略的主要不足之处在于对哨兵家禽的管理，因为它们必须要做上标记并且单独笼养，同时也认为那些野生鸟类增加了畜禽感染禽流感的风险。

2　亚单位疫苗

禽流感病毒入侵时，动物首先针对血凝素蛋白和神经氨酸酶蛋白产生具有保护作用的抗体，只有含这两种蛋白的疫苗才可能对禽类有保护作用。并且血凝素抗体对保护性特别重要，许多试验用的亚单位疫苗只含有血凝素蛋白。一些不同类型的亚单位疫苗，包括病毒载体疫苗和在其他系统中表达的蛋白疫苗，都具有对高致病性禽流感(HPAI)的保护作用。亚单位疫苗给A型流感的血清学监测提供了最灵活的检测方式，特别是AGID和ELISA检验，能专门检测基质蛋白(MA)或核蛋白(NP)等结构蛋白。用血凝素表达蛋白所制备的工程疫苗免疫的家禽不会对MA或NP抗原产生抗体，这就使野毒感染和疫苗免疫的家禽产生了明显的区别，即野毒感染禽类有HA、MA、NP抗体，而疫苗免疫的禽类只有HA抗体。

亚单位疫苗也有一些缺点，最大的缺点为它是活的病毒载体疫苗调整而来的。病毒载体疫苗要比其他的疫苗更难获得批准，因为考虑到病毒可能会传染非易感动物而造成病毒的蔓延。以前，禽痘重组疫苗获得了批准，是因为它不会在禽类之间传播。另外一个缺点是消费者反对食用由疫苗进行基因改良的产品，这种情况在欧洲更甚，越来越多的反对声使疫苗在这些国家很难获得批准，至少在短时间内限制了这类疫苗的作用，最终限制了鉴别疫苗免疫和野毒感染禽类的灵敏度。

3　异源神经氨酸酶策略

流感病毒基因由一些不连续的节段组成，能编码10种不同的蛋白，包括2种表面糖蛋白，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。HA有16种亚型，异源神经氨酸酶(NA)有9种亚型，并且HA和NA能任意重组，则可产生144种不同亚型的流感病毒，但有些亚型重组要比其他亚型更频繁(如H5N2)。虽然HA和NA都能产生保护性抗体，但是HA抗体的保护性更重要，而一种疫苗只能对其同源HA亚型的流感病毒产生保护力。因此，使用异源NA亚型的标准灭活疫苗是有效的，这为鉴别诊断策略在血清学上检测提供了可能，它能定点检测出NA蛋白。例如，如果流行H7N2亚型禽流感，可以接种H7N3或者其他7种亚型的疫苗。对N3蛋白的血清学监测可以证实畜禽为疫苗免疫，对N2蛋白的血清学监测可以判断出野毒感染。已经免疫过的家禽和正在遭受感染的家禽也能被区分开来。20多年前就已经提出了异源NA策略，但近年才开始实际应用。

应用异源NA虽然取得初步成果，但仍然很难检测。同时，这种策略也有一些潜在的问题必须在广泛使用之前得到解决。首先，是对亚单位片段进行血清学检测的灵敏度。其次，要使用合适的毒株作为疫苗以及具有相对应的诊断分析方法。例如，意大利在过去的5年里分别暴发了H7N1、H7N2和H5N2亚型的禽流感。因此，必须使用3种不同的异源NA血清型的疫苗，且要选取与野生毒株最匹配的抗原蛋白。每种毒株都要保存，并在暴发禽流感时能快速鉴定出野生毒株的亚型，这就使得疫苗开始使用的时间延迟了。克服这种缺陷的方法是使用反向基因构造病毒，使它和感染毒株具有相同的血凝素基因和相匹配的异源NA亚型。这种方法在试验中效果很好并且能及时完成，但是很难调整，缺乏灵活性，必须在应用以前先在野生禽类试用。

诊断方法的应用也是一个难题，神经氨酸酶抑制(NI)试验可以鉴定出9种NA亚型，但是这种试验不能筛取大量样本。意大利鉴别诊断策略采用iIFA定向检测N1蛋白是一种快速而简便的试验方法，可是iIFA试验并不是适合所有的NA亚型，并且试验结果很难解释。一种正在开发的ELISA方法有可能会提供一种灵敏高效的检测方法。

4　非结构蛋白策略

近年来提出了一种可选择的非结构蛋白(NS1)策略，它利用了流感病毒NS1免疫反应的差异。细胞感染流感病毒时会产生大量的NS1蛋白，但病毒粒子内不存在这种成分。禽流感灭活疫苗主要是全病毒粒子，理论上疫苗免疫动物不会产生NS1蛋白的抗体反应，而野毒感染动物则会产生这种反应。NS1试验不仅能区分疫苗免疫和野毒感染家禽，而且也能鉴定疫苗免疫和正遭受感染的家禽^[12]。此外，这种鉴定能力让贸易伙伴们相信他们的禽类没有受到野毒感染。

NS1策略与NA策略相比，前者的最大优势是适用于任何一种灭活疫苗并且只需要一种诊断方法，而NA策略需要进行多种诊断方法。此外，NS1系统要求疫苗中HA和NA都要匹配，潜在地提高了保护性。NS1策略最大的缺点是潜在的NS1蛋白污染对试验结果造成的影响。和亚单位疫苗与NA策略一样，NS1策略同样存在灵敏度不高的问题^[13]。

5　结语

采用接种疫苗控制禽流感的暴发会成为一种有效的措施，但完整的控制计划中还应该包括：生物安全、培育、监测和对疫苗效果的评价。近年来，在使用鉴别诊断策略上所做的努力增强了对野毒感染禽流感病毒的监测能力，确保了家禽和家禽产品贸易的安全性。