刘平、刘东、李彬、王群义、郇秀荣、王宗升、范根成、杜元钊<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

农业部动物检疫所青岛易邦生物工程有限公司

摘要：目前在禽流感血凝抑制试验方面存在很多问题，会对血凝抑制试验的意义造成影响从而导致不正确的结果；禽流感抗原也存在相的差异，在实际检测中也容易出现误导。

关键词：　血凝抑制　相的差异　标定　

Problems in Hemagglutimation Inhibition Test with Avian Influenza

Liu Ping , Liu Dong , Li Bin , Wang QunYi ,Huan XiuRong,

Wang ZongSheng ，Fan GenCheng,　Du YuanZhao

Qingdao YEBIO Bioengineering Co,National Animal Quarantine Institute ,Ministry of Agriculture ,Qindao <?xml:namespace prefix = st1 ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:smarttags" />Shandong

Abstract: Quite a few problems exist with regard to hemagglutination test with avan influenza,affecting HI test meanings and leading to wrong results.Phase variation exists in avian influanza antigen,causing mistakes in practical operation of HI test.

Keywords: Hemagglutination inhibition,phase variation,

standardization

禽流感病毒能够与鸡红细胞发生凝集现象，这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制实验（HI）。由于血凝反应可被特异性抗体所抑制，抗体与病毒结合后，血凝素不能吸附于红细胞表面的受体上，因此血凝抑制试验可以用于：1）检测血清中的抗体水平。2）鉴定病毒。3）辅助诊断病毒性疾病。4）作为适时免疫的辅助手段，能避免免疫失败、免疫空挡及重复免疫造成的损失。目前在禽流感血凝抑制试验方面存在很多问题，会对血凝抑制试验的意义造成影响从而导致不正确的结果。

一、 由于禽流感病毒变异较快，所以在血凝抑制试验中经常会出现不同厂家生产的相同亚型的禽流感抗原所测同一血清的血凝抑制价不同，禽流感亚型病毒株按其血凝抑制试验中所表现的亲和力不同而分为三种类型：对本株和异株免疫血清均呈较高效价的为“R”相；对本株效价高对异株低的为“P”相；对本株及异株均低的为“Q”相。由此可见养殖户经常反映的打你们厂家的疫苗去别的地方检测结果往往会很低，这就是我们所说的“P”相，即抗原相的差异。如果在试验中出现相的差异所测结果会相差2-3个滴度，所以在血凝抑制试验操作时，挑选亲和相毒株作为测定抗原较好，这样会提高诊断的灵敏度(如下表)。对禽流感毒株进行抗原分析时，必须采用交叉的血凝抑制试验，而不能采用单向的血凝抑制测定，以排除相别的影响。

同一血清用不同抗原检测的结果

抗原

血清

“Ｒ”相

“Ｑ”相

“Ｐ”相

１－Ｐ

2⁸

2⁵

2⁹

２－Ｒ

2⁸

2⁶

2⁶

３－Ｑ

2⁹

2⁶

2⁵

二、 禽类血清中往往含有非特异性血凝抑制因子，尤其是水禽血清在做禽流感血凝抑制试验时会出现对照孔和对照孔后2-3孔有凝集现象。因此，在利用血凝抑制试验进行血清抗体测定之前，有必要对血清中非特异性因子进行排除。热灭活是一种排除非特异性因子的有效方法，但对特异性抗体破坏较大。利用受体裂解酶处理血清在美国禽流感诊断中已广泛应用。但经过我们大量的临床试验发现水禽血清在经过受体裂解酶处理后有明显的差异，而鸡的血清却没有明显差异，所以在做血凝抑制试验时可对水禽血清用受体裂解酶进行处理，鸡血清不作处理结果影响不大。

三、在禽流感血凝抑制试验中抗原标定也是至关重要的一个环节。首先在试验之前要对禽流感抗原用已知效价的标准阳性血清进行标定，以确定抗原的纯度。抗原配制完后，需对所配制的抗原进行标定，看所配制的抗原是否达到所需标准，如工作抗原效价过高或过低对结果都有一定的影响。过高，测定抗体效价偏低；过低，测定效价过高，甚至很高。所以在禽流感血凝抑制试验中必须对抗原进行标定。

四、在进行试验操作时很容易出现错误，所以进行实验时一定要严格操作，每次测定应有严格的温度范围和作用时间，出现错误时要认真查找原因，以免类似错误再次出现。另外，所用抗原应是稳定性好，效价高的浓缩抗原。以下是容易出现的错误：

1.对照孔凝集

① 盐类凝集：所谓盐类凝集即稀释液中氯化钠达至一定高浓度时，即使没有血清抗体也能发生凝集反应。

② 当生理盐水被细菌污染时也可出现对照孔凝集。

③ 血清变质或受细菌污染。

2.全部凝集

① 当红细胞受细菌污染或保存时间过长可出现此现象。

② 抗原滴加时出现失误，工作抗原效价过高。

① 生理盐水受细菌污染或其它因素.

3、 红细胞全部下滑

①当配制抗原时，配制工作抗原效价过低，不足以凝集鸡红细胞。

②加样时所有孔全部加成生理盐水亦出现全部下滑现象。

4、不同来源、不同浓度的红细胞会使结果差异很大，所以红细胞来源一定要相同：

一般需要3只或3只以上公鸡来提供红细胞，将3只以上公鸡红细胞混合在一起。也可由1只公鸡来提供红细胞，但必须经临床多次使用证明是可行的。有抗体鸡提供的红细胞需要更多次数洗涤。但要注意有时不同的公鸡提供的红细胞对禽流感H5亚型抗体测定，效价差异很大。不同浓度的红细胞对抗体测定也有影响。

5、温度对实验结果也有影响，一般要求在室温25-37℃进行实验，当实验温度低于4℃时红细胞有时会发生自凝现象。

6、抗原与抗体作用时间过长或过短对结果影响较大：过短出现凝集不完全；过长出现洗脱现象。

7、96孔V型板是否洗净，是否光滑也会影响实验结果。

总之在进行禽流感血凝抑制试验时应综合考虑各方面因素，制定一个标准化操作方法以免对结果判断产生误差，只有把试验标准化才能正确评价疫苗免疫存在的意义。